A multi-layered defense: spray-induced gene silencing and CRISPR/Cas9 technologies to improve Castanea sativa tolerance to pathogens

The European chestnut (Castanea sativa) represents a fundamental resource for both the ecosystem and rural economy, especially in Italy, thanks to its production of timber and chestnuts. However, climate change is increasing the vulnerability of this species, exposing it to greater abiotic and biotic stress. Among the latter, ink disease—caused by the pathogen Phytophthora cinnamomi—has strongly re-emerged, threatening chestnut orchards and forests. To address this challenge, the study investigated two innovative biotechnological approaches: gene editing via CRISPR/Cas9 and Spray-Induced Gene Silencing (SIGS), with the aim of increasing the chestnut’s resistance to the pathogen. For gene editing, pmr4 was selected as the candidate gene, known for its involvement in pathogen susceptibility in other plant species. Embryogenic lines of C. sativa were transformed to inactivate these genes, and their response to P. cinnamomi infection was subsequently evaluated. The edited lines for pmr4, in particular pmr4_1 and pmr4_4BIS, showed high tolerance, with a 100% survival rate and a significant reduction in necrosis compared to controls. These findings suggest that inactivating pmr4 may activate the salicylic acid pathway, which plays a central role in plant immune response, thus enhancing resistance to the pathogen. However, further studies are needed to assess potential side effects on plant growth and development. In parallel, the study explored the potential of SIGS technology, which involves the exogenous application of double-stranded RNA (dsRNA) to silence essential pathogen genes. Bioinformatic analyses identified the Dicer-like (dcl) gene of P. cinnamomi, which is conserved and involved in the production of siRNAs. Treatment with dcl-specific dsRNA significantly reduced pathogen growth both in vitro and in detached leaf assays. Despite the promising results, some challenges remain. Genetic transformation in tree species, including C. sativa, still shows relatively low efficiency (5.8% for pmr4), necessitating the optimization of regeneration protocols. Moreover, the tolerance observed under controlled conditions must be confirmed in real environments to verify long-term stability. For SIGS, the main obstacles are related to environmental degradation of dsRNA and its limited penetration into pathogen cells. Further research is needed to improve treatment formulations. This work demonstrates the effectiveness of pmr4 gene inactivation via CRISPR/Cas9 as a promising strategy to increase chestnut tolerance to P. cinnamomi. At the same time, SIGS technology proved useful in temporarily reducing pathogen growth, although it requires further development for stable field application. Looking ahead, integrating advanced biotechnological tools with sustainable agronomic practices may offer effective solutions for protecting chestnut trees and other strategic tree crops in the face of increasingly significant climate change.

Il castagno europeo (Castanea sativa) rappresenta una risorsa fondamentale per l’ecosistema e l’economia rurale, specialmente in Italia, grazie alla produzione di legname e castagne. Tuttavia, il cambiamento climatico sta aumentando la vulnerabilità di questa specie, esponendola maggiormente a stress abiotici e biotici. Tra questi ultimi, la malattia dell’inchiostro, causata dal patogeno Phytophthora cinnamomi, è riemersa con forza, minacciando le coltivazioni e le foreste castanicole. Per rispondere a questa sfida, lo studio ha indagato due approcci biotecnologici innovativi: l’editing genetico tramite CRISPR/Cas9 e la tecnologia SIGS (Spray-Induced Gene Silencing), con l’obiettivo di aumentare la resistenza del castagno al patogeno. Per l’editing genetico è stato scelto come candidato pmr4, noto per la sua implicazione nella suscettibilità ad agenti patogeni in altre specie vegetali. Le linee embriogeniche di C. sativa sono state trasformate per inattivare questi geni, valutandone successivamente la risposta all’infezione da P. cinnamomi. Le linee modificate per pmr4, in particolare pmr4_1 e pmr4_4BIS, hanno mostrato una tolleranza elevata, con un tasso di sopravvivenza del 100% e un’elevata riduzione della necrosi rispetto ai controlli. Questi dati suggeriscono che l'inattivazione di pmr4 potrebbe attivare la via dell’acido salicilico, nota per il ruolo centrale nella risposta immunitaria delle piante, incrementando così la resistenza al patogeno. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per valutare eventuali effetti collaterali sulla crescita e sullo sviluppo delle piante. Parallelamente, lo studio ha esplorato il potenziale della tecnologia SIGS, che prevede l’applicazione esogena di RNA a doppio filamento (dsRNA) per silenziare geni essenziali del patogeno. Attraverso analisi bioinformatiche è stato identificato il gene Dicer-like (dcl) di P. cinnamomi, conservato e coinvolto nella produzione di siRNA. Il trattamento con dsRNA specifico per dcl ha ridotto significativamente la crescita del patogeno sia in vitro sia in test su foglie staccate. Nonostante i risultati promettenti, permangono alcune criticità. La trasformazione genetica nelle specie arboree, inclusa C. sativa, mostra ancora efficienze relativamente basse (5,8% per pmr4), rendendo necessaria un’ottimizzazione dei protocolli di rigenerazione. Inoltre, la tolleranza osservata in condizioni controllate dovrà essere confermata in ambienti reali, per verificarne la stabilità nel lungo periodo. Per il SIGS, il principale ostacolo è legato alla degradazione ambientale del dsRNA e alla limitata penetrazione nelle cellule del patogeno. Sono auspicabili ulteriori ricerche volte a migliorare la formulazione dei trattamenti Questo lavoro dimostra l’efficacia dell’inattivazione del gene pmr4 mediante CRISPR/Cas9 come strategia promettente per aumentare la tolleranza del castagno a P. cinnamomi. Parallelamente, la tecnologia SIGS si è rivelata utile per ridurre temporaneamente la crescita del patogeno, sebbene necessiti di ulteriori sviluppi per una sua applicazione stabile in campo. In prospettiva, l’integrazione di strumenti biotecnologici avanzati con pratiche agronomiche sostenibili potrà offrire soluzioni efficaci per la protezione del castagno e di altre colture arboree strategiche, in un contesto di cambiamenti climatici sempre più rilevanti.