Cosa regola la ricombinazione meiotica nel centromero delle piante ?

Meiotic recombination is essential for proper chromosome segregation and leads to genetic diversity. However, centromeric regions are known to be recombination cold spots, limiting genetic variability in these regions. This study aimed to investigate the role of CENH3 and SGO in centromeric recombination frequency in Arabidopsis thaliana using the Fluorescent Tagged Lines (FTL) system. To achieve this, an F2 segregating population carrying the cenh3 mutation and the GFP-tailswap insertion was generated and analyzed through PCR genotyping and phenotyping using fluorescence microscopy. Flow cytometry was used to confirm ploidy levels. Additionally, SGO mutant lines were crossed with CEN5 and CEN3 FTL marker lines to establish a suitable background for future recombination studies. Recombination events were analyzed using the FTL system in a subset of selected individuals. Results showed that cenh3-/- GFP-tailswap-/- homozygous plants exhibited significant pollen defects, preventing high-throughput FTL analysis. However, an alternative approach using squash microscopy allowed partial visualization of pollen inside the anther and, with the proper optimizations, potentially also for recombination frequency analysis. Moreover, the study successfully performed crosses between SGO mutant lines and centromeric marker lines, resulting in seed collections for future FTL analysis, though the successful generation of the intended lines remains to be verified. These findings highlight the limitations of traditional FTL protocols for genotypes with low pollen production, emphasizing the need for optimized methodologies. Future work could explore alternative markers or sequencing-based approaches to enhance recombination analysis in centromeric regions.

La ricombinazione meiotica è essenziale per la corretta segregazione dei cromosomi e per garantire diversità genetica. Tuttavia, è noto che le regioni centromeriche sono “cold sport” per la ricombinazione, limitando la variabilità genetica in queste aree. Questo studio ha avuto come obiettivo investigare il ruolo di CENH3 e SGO nella frequenza di ricombinazione centromerica in Arabidopsis thaliana, utilizzando il sistema Fluorescent Tagged Lines (FTL). Per raggiungere questo scopo, è stata generata una popolazione segregante F2 contenente la mutazione cenh3 e l'inserzione GFP-tailswap, analizzata mediante genotipizzazione PCR e fenotipizzazione tramite microscopia a fluorescenza. La citometria a flusso è stata utilizzata per confermare i livelli di ploidia. Inoltre, le linee mutanti di SGO sono state incrociate con le linee marcate CEN5 e CEN3 FTL per creare un background adatto agli studi sulla ricombinazione. Gli eventi di ricombinazione sono stati analizzati utilizzando il sistema FTL su un sottoinsieme di individui selezionati. I risultati hanno mostrato che le piante omozigoti cenh3-/- GFP-tailswap-/- presentavano difetti significativi nella produzione di polline, impedendo un'analisi FTL ad alta produttività. Tuttavia, un approccio alternativo basato sulla microscopia “pollen squash method” ha permesso una visualizzazione parziale del polline all'interno delle antere e, con le dovute ottimizzazioni, potrebbe potenzialmente consentire l'analisi della frequenza di ricombinazione. Inoltre, lo studio ha permesso di effettuare con successo incroci tra le linee mutanti di SGO e le linee marcate centromeriche, raccogliendo semi per future analisi FTL, anche se l'effettiva generazione delle linee desiderate deve ancora essere verificata. Questi risultati evidenziano le limitazioni dei protocolli FTL tradizionali per genotipi con ridotta produzione di polline, sottolineando la necessità di metodologie ottimizzate. I lavori futuri potrebbero esplorare marcatori alternativi o approcci basati sul sequenziamento per migliorare l'analisi della ricombinazione nelle regioni centromeriche.