Strategies for the production of monoterpene derivatives in tobacco biofactories

In recent decades, the increasing prevalence of phytophagous insects—exacerbated by climate change and globalization—has highlighted the limitations of conventional control strategies based on synthetic insecticides, which are often problematic due to the emergence of insect resistance and negative environmental impacts. In this context, sexual pheromones offer a promising alternative for controlling harmful insect populations without the risks associated with pesticides. In particular, irregular monoterpenes (IMs), characterized by atypical carbon skeletons formed through non- “head-to-tail” bonds, are employed as sexual pheromones by certain scale insect species, thus opening the door to sexual confusion strategies. The high cost of chemically synthesizing IMs and the recent discovery of plant biosynthetic genes have driven the use of tobacco as a biofactory for their production. While this strategy has demonstrated validity, it is limited by phytotoxic effects caused by the accumulation of IMs in thylakoid membranes, which can compromise photosynthetic processes. The thesis focuses on optimizing tobacco to reduce such adverse effects and enhance both the production and volatilization of IMs. The project is organized into several experimental phases. First, two trichome-specific promoters (pNtCBTS2α and pCYP71D16), isolated from the Nicotiana cultivar K326, were tested using a stable transformation of N. tabacum with promoter-reporter gene fusions (GFP and DsRed). Confocal microscopy analysis confirmed specific expression in glandular trichomes, potentially confining IM biosynthesis to specialized structures and thus reducing phytotoxic effects. In parallel, the co-expression of transporters likely involved in monoterpene detoxification was evaluated. The ABCB1 transporter is responsible for extruding IMs from the cell membranes, whereas LTPs are involved in transferring IMs from the cell wall to the apoplast and in accumulating them in the subcuticular cavities of peltate trichomes in aromatic plants. However, transient expression analysis in N. benthamiana revealed a marked decrease in IM emission when LTPs were expressed, suggesting a strong sequestering effect exerted by these proteins. Finally, the study evaluated the activity of the acetyltransferase LiAAT4 in converting the monoterpene TND into the acetylated derivative TNDAc, identified as a component of the sexual pheromone of an invasive scale insect. This enzyme had previously shown activity on a major IM, lavandulol, leading to its conversion into lavandulyl acetate. Its activity was tested both through transient expression in N. benthamiana and via stable transformation in N. tabacum, with GC-MS analysis confirming the exclusive production of TNDAc in samples co-expressing the enzyme. This result opens promising prospects for developing biodispenser plants capable of controllably emitting volatile compounds useful for integrated pest management, particularly in controlled environments such as greenhouses. Overall, this work provides a proof of concept for employing tobacco as a biofactory for the controlled production and release of IMs, laying the foundation for sustainable biotechnological strategies. Future developments will need to address further optimization—particularly balancing production, transport, and volatilization—to achieve economically viable solutions applicable to crop protection.

Negli ultimi decenni l’aumento degli insetti fitofagi, amplificato dai cambiamenti climatici e dalla globalizzazione, ha messo in luce le limitazioni delle strategie di controllo tradizionali basate su insetticidi sintetici, spesso inefficaci a causa della resistenza degli insetti e degli impatti ambientali negativi. In tale contesto, i feromoni sessuali offrono una valida alternativa per controllare le popolazioni di insetti dannosi, eliminando i rischi legati ai pesticidi. In particolare, i monoterpeni irregolari (MI), caratterizzati da scheletri atipici dovuti a legami non “testa-coda”, sono usati come feromoni sessuali da alcune specie di cocciniglia, aprendo la strada a strategie di confusione sessuale. L’alto costo della sintesi chimica di MI e la recente scoperta di geni biosintetici in pianta hanno spinto verso l’impiego del tabacco come biofabbrica per la loro produzione. Questa strategia si è dimostrata valida, seppur con limitazioni legate alla fitotossicità causata dall’accumulo dei MI nelle membrane tilacoidali, problema che può compromettere i processi fotosintetici. La tesi si concentra sull’ottimizzazione del tabacco per ridurre tali effetti negativi e aumentare la produzione e la volatilizzazione dei MI. Il progetto si articola in diverse fasi sperimentali. In primo luogo, sono stati testati due promotori tricomali (pNtCBTS2α e pCYP71D16) isolati dalla cultivar K326 di Nicotiana tabacum, utilizzando una trasformazione stabile di N. tabacum con i promotori fusi a geni reporter (GFP e DsRed). L’analisi mediante microscopia confocale ha confermato l’espressione specifica nei tricomi ghiandolari, permettendo potenzialmente di confinare in strutture specializzate la biosintesi dei MI, riducendo di conseguenza gli effetti fitotossici. Parallelamente, è stata valutata la co-espressione di trasportatori probabilmente coinvolti nella detossificazione dei monoterpeni. Il trasportatore ABCB1 è deputato all’estrusione di MI dalle membrane cellulari, mentre le LTPs sono coinvolte nello spostamento dei MI dalla parete all’apoplasto e nell’accumulo nelle cavità sottocuticolari dei tricomi peltati di piante aromatiche. L’analisi in espressione transiente in N. benthamiana ha però mostrato un forte calo dell’emissione di MI quando le LTPs sono state espresse, suggerendo un forte effetto di sequestro esercitato da queste ultime. Infine, lo studio ha valutato l’attività dell’acetiltransferasi LiAAT4 nella conversione del monoterpene TND nel derivato acetilato TNDAc, identificato come costituente del feromone sessuale di una cocciniglia invasiva. Questo enzima si era già dimostrato attivo su un alto MI, il lavandulolo, portando alla conversione in lavandulyl acetato. La sua attività è stata testata sia mediante espressione transiente in Nicotiana benthamiana che tramite trasformazione stabile in N. tabacum, con l’analisi GC-MS che ha confermato la produzione esclusiva di TNDAc nei campioni co-esprimenti l’enzima. Tale risultato apre interessanti prospettive per lo sviluppo di piante biodispenser capaci di emettere, in modo controllato, composti volatili utili per la difesa integrata, particolarmente in ambienti protetti come le serre. Complessivamente, il lavoro fornisce una prova di principio per l’impiego del tabacco come biofabbrica per la produzione e l’emissione controllata di MI, gettando le basi per strategie biotecnologiche sostenibili. I futuri sviluppi dovranno affrontare ulteriori ottimizzazioni, in particolare nel bilanciamento tra produzione, trasporto e volatilizzazione, per realizzare soluzioni economicamente sostenibili e applicabili nella protezione delle coltivazioni.