Valutazione dell'efficacia di microrganismi endofiti nel contenimento di malattie delle mele

The production of apples plays a significant role in the Italian and international markets, as it represents one of the main crops produced in Italy and Europe. Every year, apple production suffers significant economic losses in the post-harvest phase due to the development of rot in cold storage warehouses. Biological control based on the use of antagonistic microorganisms in post-harvest is considered a promising alternative to synthetic agrochemicals, whose use is increasingly limited by European legislation. Endophytic yeasts and bacteria, thanks to their close association with fruit tissues, may have the ability to contain, through multiple mechanisms of action, the development of pathogenic fungi that cause rot. In this work, an experimental characterization and evaluation of the efficacy of native endophytic strains from apple pulp was conducted in order to identify potential biological control agents on apples. First, 25 candidate strains, including yeasts and bacteria, were identified by molecular methods and were grown in vitro to analyze their growth at different temperatures. Subsequently, some in vivo biological control trials were conducted at room temperature to evaluate their ability to contain three emerging pathogens in Italy: Phlyctema vagabunda, Colletotrichum acutatum Species Complex (SC) and Colletotrichum gloeosporioides SC. Furthermore, the pathogen C. acutatum SC was selected to evaluate the efficacy of the three best performing strains in a large-scale in vivo efficacy trial at low temperatures. Finally, to obtain some initial information on the mechanism of action, these same strains were subjected to preliminary in vitro trials to evaluate the production of diffusible and volatile metabolites with antifungal action against C. acutatum SC. Molecular identification revealed that the endophytic strains belong to taxonomic groups already known in literature for their use in biological control. Based on the results of the growth test at different temperatures, yeasts and bacteria were found to be suitable for post-harvest applications. In in vivo tests against the three pathogens, yeasts reported slightly better results than bacterial strains. In particular, the most effective strains were found to belong to the species Aureobasidium pullulans, Metschnikowia pulcherrima and Pantoea sp. Finally, preliminary analyses on the mechanisms of action allowed us to formulate some hypotheses about the possibility that the strains that emerged as most effective exploit a combination of multiple modes of action. To complete the picture outlined by this work, a more accurate molecular characterization and a comprehensive investigation of the mechanisms of action could be carried out in future studies. On the basis of the results obtained, it was possible to state that endophytic microorganisms constitute a promising source of antagonistic agents that can be used in biological control against primary and secondary pathogens of apples, since the majority of the tested strains determined a significant containment of rot.

La produzione di mele ricopre una posizione rilevante per il mercato italiano e internazionale, collocandosi tra le principali colture in Italia e in Europa. Ogni anno, la produzione di mele registra ingenti perdite economiche nella fase di post-raccolta a causa dello sviluppo di marciumi nei magazzini per la frigoconservazione. La lotta biologica basata sull’utilizzo di microrganismi antagonisti in post-raccolta è considerata una promettente alternativa agli agrofarmaci di sintesi, il cui impiego è sempre più limitato dalla normativa europea. Lieviti e batteri endofiti, grazie alla loro stretta associazione con i tessuti del frutto, possono avere la capacità di contenere, attraverso molteplici meccanismi d’azione, lo sviluppo di funghi patogeni agenti di marciumi. In questa tesi di laurea è stata condotta sperimentalmente una caratterizzazione e valutazione dell’efficacia di ceppi endofiti nativi della polpa di mela, allo scopo di individuare potenziali agenti di lotta biologica su mele. Innanzitutto, 25 ceppi candidati, tra lieviti e batteri, sono stati identificati con metodi molecolari e sono stati coltivati in vitro per analizzare la loro crescita a diverse temperature. Successivamente, sono state condotte alcune prove di lotta biologica in vivo a temperatura ambiente per valutare la loro capacità di contenimento di tre patogeni emergenti in Italia: Phlyctema vagabunda, Colletotrichum acutatum Species Complex (SC) e Colletotrichum gloeosporioides SC. Inoltre, è stato selezionato il patogeno C. acutatum SC per valutare l’efficacia dei tre ceppi migliori in una prova di efficacia in vivo su larga scala e a basse temperature. Infine, per ottenere alcune informazioni iniziali sul meccanismo d’azione, questi stessi ceppi sono stati sottoposti a prove preliminari in vitro per valutare la produzione di metaboliti diffusibili e volatili con azione antifungina verso C. acutatum SC. L’identificazione molecolare ha rivelato l’appartenenza dei ceppi endofiti a gruppi tassonomici già noti in letteratura per il loro impiego in lotta biologica. Sulla base dei risultati emersi dalla prova di crescita a diverse temperature sia lieviti che batteri sono risultati idonei ad un impiego in post-raccolta. Nelle prove in vivo contro i tre patogeni, i lieviti hanno riportato risultati leggermente migliori rispetto ai ceppi batterici. In particolare, i ceppi più efficaci sono risultati appartenenti alle specie Aureobasidium pullulans, Metschnikowia pulcherrima e Pantoea sp. Infine, le analisi preliminari sui meccanismi d’azione hanno permesso di formulare qualche ipotesi circa la possibilità che, i ceppi emersi come più efficaci, sfruttino una combinazione di più modalità d’azione. Per completare il quadro delineato dal presente lavoro, si potrebbero effettuare, in studi futuri, una caratterizzazione molecolare più accurata e un’indagine integrale sui meccanismi d’azione. Sulla base dei risultati conseguiti, è stato possibile affermare che i microrganismi endofiti costituiscono una promettente fonte di agenti antagonisti utilizzabili in lotta biologica contro patogeni principali e secondari delle mele, in quanto la maggior parte dei ceppi saggiati ha determinato un contenimento significativo dei marciumi.