Messa a punto e valutazione di condizioni operative per la misurazione dell'attività di Asparaginasi per uso in ambito industriale

Acrylamide, commonly known in chemistry as 2-propenamide, is a compound commonly used in biochemistry to study protein structure and function or in industry for polymer synthesis. Despite its many uses, acrylamide has been classified as a “probable human carcinogen” (Group 2A) by the International Agency for Research on Cancer (IARC), and humans are exposed to it mainly through inhalation of tobacco smoke and by ingestion by consuming foods that have been subjected to the Maillard reaction. A food matrix presenting the amino acid asparagine and reducing sugars, when exposed to a temperature of about 120°C, promotes the Maillard reaction. This is responsible for the release of fragrance from volatile Amadori compounds as much as the golden color that foods such as meat or baked goods take on following their cooking. Due to the harmful effects exerted by acrylamide on human health, in April 2018 Regulation (EU) 2017/2158 issued by the European Commission came into force in which the maximum amount of acrylamide (µg/Kg) allowed in different food matrices (e. g. baby food (40 µg/Kg); wheat-based breads (50 µg/Kg); breakfast cereals (150-300 µg/Kg); cookies and wafers (350 µg/Kg); chicory-derived coffee substitutes (4000 µg/Kg)). Accordingly, several strategies were adopted for compound mitigation in dietary intake matrices. These involved raw material selection, product composition and optimization of processing conditions. The strategy that proved most effective, however, involved pretreatment of the food matrices with L-Asparaginase enzymes, which allow the conversion of the substrate asparagine (Asn) into the products aspartate (Asp) and ammonia (NH3), which are not subject to the Maillard reaction. Specifically, this study was initially concerned with developing an analytical method for measuring the catalytic activity of L-Asparaginase (E1, E2, E3, E4 and E5) in purity. Three enzyme kits were used: the Enzytech™ Liquid Ammonia (R-Biopharm®), the ab107922 (abcam ®) and the DASN-100 (QuantiFluo™ BioAssay Systems) to understand which among them was the suitable one to be applied in the industrial setting to carry out quality control of the raw material at the acceptance stage. Next, an analytical approach was developed for the determination of enzyme dosage in a dilute system in food matrix. Finally, the study was concluded by measuring the enzyme catalytic activity in the diluted system to verify whether the biocatalyst maintained its catalytic stability and efficiency.

L’ acrilamide, conosciuta comunemente in ambito chimico in qualità di 2-propenamide, è un composto utilizzato comunemente in ambito biochimico per lo studio della struttura e della funzione proteica o in ambito industriale per la sintesi di polimeri. Nonostante i molteplici impieghi, l’acrilamide è stata classificata come “probabile cancerogeno per l’uomo” (Gruppo 2A) dall’Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro (IARC) e l’uomo ne subisce l’esposizione principalmente attraverso l’inalazione di fumo da tabacco e per ingestione, assumendo cibi che siano stati soggetti alla reazione di Maillard. Una matrice alimentare presentante l’aminoacido asparagina e zuccheri riducenti, se esposta ad una temperatura di circa 120°C, promuove la reazione di Maillard. Questa è responsabile dello sprigionamento di profumi per via dei composti volatili di Amadori, quanto del colore dorato che assumono i cibi quali carne o prodotti da forno a seguito della loro cottura. A causa degli effetti dannosi esercitati dall’acrilamide sulla salute umana, nell’aprile del 2018 entrò in vigore il Regolamento (UE) 2017/2158 emanato dalla Commissione Europea in cui venne stabilito il quantitativo massimo di acrilamide (µg/Kg) permesso nelle diverse matrici alimentari (e.g. alimenti per neonati (40 µg/Kg); pane a base di grano (50 µg/Kg); cereali per la colazione (150-300 µg/Kg); biscotti e wafer (350 µg/Kg); sostituti del caffè derivati dalla cicoria (4000 µg/Kg)). Di conseguenza, vennero adottate diverse strategie per la mitigazione del composto in matrici assunte con la dieta. Queste riguardarono la selezione delle materie prime, la composizione del prodotto e l'ottimizzazione delle condizioni di lavorazione. La strategia che si rivelò più efficace però, riguardò il pretrattamento delle matrici alimentari con enzimi L-Asparaginase, che permettono la conversione del substrato asparagina (Asn) nei prodotti aspartato (Asp) ed ammoniaca (NH3), i quali non sono soggetti alla reazione di Maillard. In particolare, in questo studio ci si è occupati inizialmente di elaborare un metodo analitico per la misurazione dell’attività catalitica di L-Asparaginase (E1, E2, E3, E4 ed E5) in purezza. Sono stati usati tre kit enzimatici: l’Enzytech™ Liquid Ammonia (R-Biopharm®), l’ab107922 (abcam ®) ed il DASN-100 (QuantiFluo™ BioAssay Systems) per comprendere quale tra questi fosse quello idoneo da applicare in ambito industriale per effettuare il controllo qualità della materia prima in fase di accettazione. Successivamente, si è proceduto con la messa a punto di un approccio analitico per la determinazione del dosaggio enzimatico in un sistema diluito in matrice alimentare. Infine, lo studio si è concluso con la misurazione dell’attività catalitica enzimatica nel sistema diluito per verificare se il biocatalizzatore mantenesse la sua stabilità ed efficienza catalitica.