Hydrogen has the potential to be a sustainable alternative to fossil fuels and is also an important reagent for many sectors. However, the technologies currently employed for hydrogen production are either low-yield or associated with greenhouse gas emissions. Producing hydrogen at high yields through sustainable approaches is possible but often requires significant investment, as in the case of water electrolysis. A possible solution lies in biohydrogen, which is hydrogen produced via microbial fermentation. This process could utilize waste materials as feedstock, providing not only cost reduction due to the use of cheaper substrates but also offering a solution for waste disposal. Among the different types of waste that could be used as feedstock, wastewater sludge is produced in large quantities due to the growing metropolitan population and is rich in nutrients such as undigested fibres and proteins. Moreover, Clostridium species, a well-studied class of hydrogen-producing microorganisms, are known to proliferate in such environments. Employing Clostridium strains to ferment sewage sludge could be a game-changing approach to hydrogen production, enabling its direct utilization within cities and reducing transportation costs. The present thesis includes two research activities aimed at enhanced hydrogen production from wastewater sludge from the Metropolitan City of Turin using Clostridium strains. In the first phase, four Clostridium strains, C. perfringens ATCC 13124, C. beijerinckii AM2, C. beijerinckii NCIMB 8052, and C. tyrobutyricum, were screened for their ability to ferment wastewater sludge and produce hydrogen in an anaerobic environment. The two strains with the highest hydrogen production were C. beijerinckii NCIMB 8052 and C. perfringens ATCC 13124; however, difficulties occurred in inactivating the gene encoding C. perfringens α-toxin (important for limiting its pathogenicity). Consequently, only C. beijerinckii NCIMB 8052 was selected for genetic modification. The second phase involved developing a plasmid for the overexpression of a [FeFe] hydrogenase in C. beijerinckii. This strategy aimed to increase the amount of hydrogenase enzymes within the cells to enhance hydrogen production. This research contributes to the advancement of biohydrogen as a viable energy source, leveraging industrial biotechnology and genetic engineering to improve microbial efficiency in waste-to-energy applications.

L'idrogeno ha il potenziale per essere un'alternativa sostenibile ai combustibili fossili ed è anche un reagente fondamentale per molti settori industriali. Tuttavia, le tecnologie attualmente impiegate per la produzione di idrogeno sono caratterizzate da basse rese o sono associate all’emissione di gas serra. Sebbene sia possibile produrre idrogeno ad alte rese attraverso approcci sostenibili, questi spesso richiedono investimenti significativi, come nel caso dell'elettrolisi dell'acqua. Una possibile soluzione risiede nel bioidrogeno, ovvero l'idrogeno prodotto tramite fermentazione microbica. Questo processo potrebbe sfruttare materiali di scarto come substrato, consentendo non solo di ridurre i costi grazie all’utilizzo di materie prime economiche, ma anche di offrire una soluzione per lo smaltimento dei rifiuti. Tra i vari tipi di rifiuti utilizzabili come substrato, i fanghi di depurazione rappresentano una risorsa abbondante, prodotta in grandi quantità a causa della crescente popolazione metropolitana, e sono ricchi di nutrienti come fibre non digerite e proteine. Inoltre, le specie del genere Clostridium, un gruppo di microrganismi ben studiato per la produzione di idrogeno, sono note per proliferare in tale substrato. L'impiego di ceppi di Clostridium per fermentare i fanghi di depurazione potrebbe rappresentare un approccio rivoluzionario nella produzione di idrogeno, permettendone l’utilizzo diretto all'interno delle città e riducendo così anche i costi di trasporto. La presente tesi include due attività di ricerca mirate all’ottimizzazione della produzione di idrogeno a partire da fanghi di depurazione della Città Metropolitana di Torino, utilizzando ceppi di Clostridium. Nella prima fase, quattro ceppi di Clostridium, C. perfringens ATCC 13124, C. beijerinckii AM2, C. beijerinckii NCIMB 8052 e C. tyrobutyricum, sono stati testati per la loro capacità di fermentare fanghi di depurazione e produrre idrogeno in condizioni anaerobiche. I due ceppi che hanno mostrato la maggiore produzione di idrogeno sono stati C. beijerinckii NCIMB 8052 e C. perfringens ATCC 13124; tuttavia, si sono riscontrate difficoltà nell'inattivazione del gene che codifica per l’α-tossina di C. perfringens (importante per ridurne la patogenicità). Di conseguenza, solo C. beijerinckii NCIMB 8052 è stato selezionato per la modifica genetica. La seconda fase ha riguardato lo sviluppo di un plasmide per la sovraespressione di una [FeFe] idrogenasi in C. beijerinckii. Questa strategia mirava ad aumentare la quantità di enzimi idrogenasi all'interno delle cellule per migliorare la produzione di idrogeno.

Optimization of Hydrogen Production from Sewage Sludge: Comparative Analysis of Clostridium Strains and Hydrogenase Overexpression in C. beijerinckii NCIMB 8052

BRANDOLA, EDOARDO
2023/2024

Abstract

L'idrogeno ha il potenziale per essere un'alternativa sostenibile ai combustibili fossili ed è anche un reagente fondamentale per molti settori industriali. Tuttavia, le tecnologie attualmente impiegate per la produzione di idrogeno sono caratterizzate da basse rese o sono associate all’emissione di gas serra. Sebbene sia possibile produrre idrogeno ad alte rese attraverso approcci sostenibili, questi spesso richiedono investimenti significativi, come nel caso dell'elettrolisi dell'acqua. Una possibile soluzione risiede nel bioidrogeno, ovvero l'idrogeno prodotto tramite fermentazione microbica. Questo processo potrebbe sfruttare materiali di scarto come substrato, consentendo non solo di ridurre i costi grazie all’utilizzo di materie prime economiche, ma anche di offrire una soluzione per lo smaltimento dei rifiuti. Tra i vari tipi di rifiuti utilizzabili come substrato, i fanghi di depurazione rappresentano una risorsa abbondante, prodotta in grandi quantità a causa della crescente popolazione metropolitana, e sono ricchi di nutrienti come fibre non digerite e proteine. Inoltre, le specie del genere Clostridium, un gruppo di microrganismi ben studiato per la produzione di idrogeno, sono note per proliferare in tale substrato. L'impiego di ceppi di Clostridium per fermentare i fanghi di depurazione potrebbe rappresentare un approccio rivoluzionario nella produzione di idrogeno, permettendone l’utilizzo diretto all'interno delle città e riducendo così anche i costi di trasporto. La presente tesi include due attività di ricerca mirate all’ottimizzazione della produzione di idrogeno a partire da fanghi di depurazione della Città Metropolitana di Torino, utilizzando ceppi di Clostridium. Nella prima fase, quattro ceppi di Clostridium, C. perfringens ATCC 13124, C. beijerinckii AM2, C. beijerinckii NCIMB 8052 e C. tyrobutyricum, sono stati testati per la loro capacità di fermentare fanghi di depurazione e produrre idrogeno in condizioni anaerobiche. I due ceppi che hanno mostrato la maggiore produzione di idrogeno sono stati C. beijerinckii NCIMB 8052 e C. perfringens ATCC 13124; tuttavia, si sono riscontrate difficoltà nell'inattivazione del gene che codifica per l’α-tossina di C. perfringens (importante per ridurne la patogenicità). Di conseguenza, solo C. beijerinckii NCIMB 8052 è stato selezionato per la modifica genetica. La seconda fase ha riguardato lo sviluppo di un plasmide per la sovraespressione di una [FeFe] idrogenasi in C. beijerinckii. Questa strategia mirava ad aumentare la quantità di enzimi idrogenasi all'interno delle cellule per migliorare la produzione di idrogeno.
Optimization of Hydrogen Production from Sewage Sludge: Comparative Analysis of Clostridium Strains and Hydrogenase Overexpression in C. beijerinckii NCIMB 8052
Hydrogen has the potential to be a sustainable alternative to fossil fuels and is also an important reagent for many sectors. However, the technologies currently employed for hydrogen production are either low-yield or associated with greenhouse gas emissions. Producing hydrogen at high yields through sustainable approaches is possible but often requires significant investment, as in the case of water electrolysis. A possible solution lies in biohydrogen, which is hydrogen produced via microbial fermentation. This process could utilize waste materials as feedstock, providing not only cost reduction due to the use of cheaper substrates but also offering a solution for waste disposal. Among the different types of waste that could be used as feedstock, wastewater sludge is produced in large quantities due to the growing metropolitan population and is rich in nutrients such as undigested fibres and proteins. Moreover, Clostridium species, a well-studied class of hydrogen-producing microorganisms, are known to proliferate in such environments. Employing Clostridium strains to ferment sewage sludge could be a game-changing approach to hydrogen production, enabling its direct utilization within cities and reducing transportation costs. The present thesis includes two research activities aimed at enhanced hydrogen production from wastewater sludge from the Metropolitan City of Turin using Clostridium strains. In the first phase, four Clostridium strains, C. perfringens ATCC 13124, C. beijerinckii AM2, C. beijerinckii NCIMB 8052, and C. tyrobutyricum, were screened for their ability to ferment wastewater sludge and produce hydrogen in an anaerobic environment. The two strains with the highest hydrogen production were C. beijerinckii NCIMB 8052 and C. perfringens ATCC 13124; however, difficulties occurred in inactivating the gene encoding C. perfringens α-toxin (important for limiting its pathogenicity). Consequently, only C. beijerinckii NCIMB 8052 was selected for genetic modification. The second phase involved developing a plasmid for the overexpression of a [FeFe] hydrogenase in C. beijerinckii. This strategy aimed to increase the amount of hydrogenase enzymes within the cells to enhance hydrogen production. This research contributes to the advancement of biohydrogen as a viable energy source, leveraging industrial biotechnology and genetic engineering to improve microbial efficiency in waste-to-energy applications.
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Descrizione: Tesi sperimentale sulla produzione di idrogeno a partire da fanghi reflui da parte di specie di Clostridium e sviluppo di un plasmide per la sovraespressione di idrogenasi eterologhe nel ceppo più promettente.
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