Caratterizzazione biochimica del citocromo P450 CYP74 di vite (Vitis vinifera) e screening dell'effetto sull'attività catalitica di alcuni fungicidi usati in agricoltura

Cytochrome P450 enzymes constitute a large family of heme-containing enzymes characterized by a wide versatility of reactions. For this reason, they exhibit significant biotechnological potential as biocatalysts, as demonstrated by the number of high-value compounds obtained and used in fields such as pharmaceuticals. Of particular interest are self-sufficient P450s that do not require a redox partner for electron transfer from NADPH. In fact, as in the case of P450 BM3, a reductase domain is fused with the catalytic module into a single polypeptide chain, giving rise to a multidomain organization. Some plant P450s, such as CYP74, can directly use the peroxide group contained in the substrate as an electron donor to complete the catalytic cycle. The aim of this project is to analyze the activity of the CYP74 enzyme from Vitis vinifera and its interaction with substrates such as 13-HPOD and 13-HPOT, as well as with various pesticides. The screening was carried out using computational, spectroscopic, and catalytic approaches. First, molecular docking was performed to predict the possible binding of the selected compounds to the active site of CYP74. Subsequently, spectroscopic binding assays were conducted to identify pesticides capable of binding to the active site. Finally, catalytic activity was analyzed by preparing reaction mixtures containing the enzyme, substrate, and a potential inhibitor (the pesticide), which, after incubation, were analyzed using HPLC. The data show that CYP74 has a high affinity for 13-HPOT, as it is its natural substrate, and that the tested pesticides do not act as enzyme inhibitors. Therefore, the results indicate that in the presence of the tested pesticides, CYP74 is still able to catalyze the consumption of 13-HPOT and 13-HPOD.

I citocromi P450 consistono in una grande famiglia di enzimi contenenti un gruppo eme e caratterizzati da un'ampia versatilità di reazioni. Per questo motivo, mostrano un rilevante potenziale biotecnologico come biocatalizzatori, dimostrato dal numero di composti di alto valore ottenuti e usati in campi come quello farmaceutico. Di particolare interesse sono i P450 autosufficienti che non necessitano di un partner redox per il trasporto degli elettroni dal NADPH. Infatti, come nel caso del P450 BM3, un dominio di reduttasi è fuso con il modulo catalitico in un'unica catena polipeptidica, dando origine un'organizzazione multidominio. Alcuni P450 di pianta, come il CYP74, possono utilizzare direttamente il come donatore di elettroni il gruppo perossido contenuto nel substrato in modo da tagliare il ciclo catalitico. Lo scopo di questo progetto è quello di analizzare l'attività dell'enzima CYP74 di Vitis vinifera e la sua interazione con substrati come il 13-HPOD e 13-HPOT e con diversi pesticidi. Lo screening è stato effettuato attraverso approcci computazionali, spettroscopici e catalitici. In primo luogo, è stato eseguito il docking molecolare per prevedere il possibile legame dei composti selezionati al sito attivo del CYP74. Successivamente sono stati eseguiti saggi di legame spettroscopici per identificare i pesticidi in grado di legarsi al sito attivo. Infine, l'attività catalitica è stata analizzata preparando miscele di reazione con enzima, substrato e possibile inibitore quale il pesticida che, dopo l'incubazione, sono state analizzate con HPLC. I dati mostrano che il CYP74 ha un' elevata affinità per il 13-HPOT in quanto suo substrato naturale, e che i pesticidi utilizzato non sono inibitori dell’enzima e quindi i dati ci mostrano che in presenza dei diversi pesticidi testati il CYP74 riesce ad effettuare la reazione di consumo di 13-HPOT e 13-HPOD.