Caratterizzazione della lignina kraft e studio d'interazione con enzimi lignolitici.

Lignin is a highly branched phenylpropanoid biopolymer that constitutes one of the main structural components of the secondary cell wall in vascular plants. It accounts for approximately 15–30% of lignocellulosic biomass and plays a crucial role in providing mechanical strength and protection against pathogens [1]. Its structure is characterized by a complex three-dimensional network, in which the monomeric units are linked by ether bonds and carbon–carbon bonds, conferring high resistance to degradation [2]. Currently, on an industrial scale, lignin is primarily a by-product of the pulp and paper industry as well as second-generation bioethanol plants. Only a small fraction is valorized for high-value applications, while the majority is burned for energy production [3]. However, its chemical structure makes it a promising resource for the production of high-value molecules, with potential applications in sustainable chemistry and biomaterials. In this thesis work, a multi-technique approach was adopted to characterize Kraft lignin in aqueous solution at different pH values, using UV-Visible spectrophotometry, Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR-ATR), and Dynamic Light Scattering (DLS). These analyses provided detailed insights into the molecular structure of lignin and its properties as a function of pH, with particular attention to its stability and aggregation in solution. In parallel, the laccase from Acinetobacter radioresistens was expressed and purified in Escherichia coli BL21, using two distinct protocols: a standard one and an optimized one aimed at improving copper integration into the enzyme's active sites. The catalytic activity of the laccase was assessed through a colorimetric assay for protein activity evaluation (ABTS assay), confirming the effectiveness of the optimization, while copper quantification in the protein sample was performed using a Copper Assay to correlate the cofactor concentration with enzymatic functionality. The results obtained provide an experimental basis for understanding the behavior of lignin in solution prior to enzymatic treatment, a crucial aspect for its use in biotransformation processes. Future perspectives of this work involve the application of the purified laccase in lignin degradation processes, with the goal of optimizing biotechnological strategies for lignocellulosic biomass valorization and the production of industrially relevant compounds.

La lignina è un biopolimero fenilpropanoide altamente ramificato che rappresenta una delle principali componenti strutturali della parete cellulare secondaria nelle piante vascolari. Costituisce circa il 15-30% della biomassa lignocellulosica e svolge un ruolo essenziale nella resistenza meccanica e nella protezione dagli agenti patogeni [1]. La sua struttura è caratterizzata da una rete tridimensionale complessa, in cui le unità monomeriche sono collegate da legami eterei e legami carbonio-carbonio, conferendole un’elevata resistenza alla degradazione [2]. Oggi, a livello industriale, la lignina è principalmente un sottoprodotto delle industrie della carta e della cellulosa, nonché negli impianti di bioetanolo di seconda generazione, solo una piccola frazione viene valorizzata per applicazioni ad alto valore aggiunto, mentre la maggior parte viene bruciata per la produzione di energia [3]. Tuttavia, la sua struttura chimica la rende una risorsa promettente per la produzione di molecole ad alto valore aggiunto, con potenziali applicazioni nella chimica sostenibile e nei biomateriali. In questo lavoro di tesi, è stato adottato un approccio multi-tecnico per caratterizzare la lignina Kraft in soluzione acquosa a diversi valori di pH, utilizzando spettrofotometria UV-Visibile, spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier (FTIR-ATR) e Dynamic Light Scattering (DLS). Queste analisi hanno permesso di ottenere informazioni dettagliate sulla struttura molecolare della lignina e sulle sue proprietà in funzione del pH, con particolare attenzione alla sua stabilità e aggregazione in soluzione. Parallelamente, è stata espressa e purificata la laccasi di Acinetobacter radioresistens in Escherichia coli BL21, con l'implementazione di due protocolli distinti: uno standard e uno ottimizzato per migliorare l'integrazione del rame nei siti attivi dell'enzima. L'attività catalitica della laccasi è stata valutata mediante un saggio colorimetrico per la valutazione dell’attività proteica (ABTS assay), confermando l’efficacia dell’ottimizzazione, mentre la quantificazione del rame proteico è stata effettuato un saggio per la valutazione della concentrazione di rame presente nel campione proteico (Copper Assay) per correlare la concentrazione del cofattore alla funzionalità enzimatica. I risultati ottenuti forniscono una base sperimentale utile per comprendere il comportamento della lignina in soluzione prima del trattamento enzimatico, aspetto fondamentale per il suo utilizzo in processi di biotrasformazione. Le prospettive future di questo lavoro riguardano l'impiego della laccasi purificata nei processi di degradazione della lignina, al fine di ottimizzare strategie biotecnologiche per la valorizzazione della biomassa lignocellulosica e la produzione di composti di interesse industriale.