Alcohol consumption, in addition to being a social and cultural phenomenon, has significant implications in medical, legal, and forensic fields. Determining alcohol intake is essential for monitoring consumption and identifying possible abuse. In addition to the traditional measurement of blood alcohol concentration (BAC), more sensitive biomarkers with a longer detection window have been identified in recent years. Among these, phosphatidylethanol (PETh) has emerged as one of the most specific and reliable indicators. PETh forms in the blood as a result of the reaction between ethanol and membrane phospholipids, remaining detectable for days or weeks after alcohol consumption. This characteristic makes it superior to other markers such as ethyl glucuronide (EtG), which has a shorter detection window. PETh analysis is performed using advanced techniques such as high-performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (MS), ensuring high sensitivity. PETh has important clinical and forensic applications: it allows for confirmation of alcohol consumption, monitoring of patients in treatment, and assessment of statements in legal contexts or relapse in rehabilitation programs. While venous sampling was traditionally used, alternative techniques such as Dried Blood Spots (DBS)—dried drops of blood on filter paper—are now becoming more common. DBS offer practical advantages: ease of collection, no need for trained healthcare personnel, and simplified transport and storage of samples. In this study, a new generation of DBS cards produced by the company HemaXis was tested. These differ from traditional Whatman 903 cards by using a smaller blood volume (10 µL instead of 30 µL). The results confirmed that these cards ensure equivalent analytical performance. HemaXis cards feature an innovative microfluidic system, which enables controlled volumetric distribution of blood on the filter paper. This is crucial to ensure standardized PETh analysis, reducing variability caused by manual sample deposition. After method verification and semi-validation, the protocol was applied to real samples from healthy individuals and patients with bipolar disorder, some of whom reported alcohol consumption. The study thus made it possible to compare PETh levels in the two groups and assess potential interactions between alcohol intake and metabolic pathways altered in bipolar disorder. The results suggest that alcohol may exacerbate such biochemical imbalances, affecting treatment response and mood stability in affected patients. Finally, the reliability of the HemaXis system was evaluated by comparing capillary blood collected with the device and venous blood deposited using a pipette. Variability was observed in the capillary results, potentially linked to hematocrit levels and the duration of finger contact with the card. Further studies will be necessary to explore these factors, define a possible uncertainty factor, and improve sampling standardization. This study confirms that PETh quantification in DBS is reliable, but the use of microfluidics requires further optimization to ensure reproducibility.
Il consumo di alcol, oltre a essere un fenomeno sociale e culturale, ha rilevanti implicazioni in ambito medico, legale e forense. La determinazione dell’assunzione di alcol è fondamentale per monitorare eventuali abusi. Oltre al classico dosaggio del tasso alcolemico (BAC), oggi sono disponibili biomarcatori più sensibili e con tempi di rilevamento più estesi. Tra questi, il fosfatidiletanolo (PETh) è uno dei più specifici e affidabili. Il PETh si forma nel sangue a seguito della reazione tra etanolo e fosfolipidi di membrana, rimanendo rilevabile per giorni o settimane dopo l’assunzione. Questo lo rende superiore ad altri marcatori come l’EtG, che ha una finestra di rilevamento più breve. L’analisi del PETh avviene mediante tecniche come HPLC e spettrometria di massa, garantendo elevata sensibilità. Il PETh ha applicazioni cliniche e forensi: consente di confermare il consumo di alcol, monitorare pazienti in trattamento e valutare dichiarazioni in ambito giudiziario o la recidiva nei programmi di riabilitazione. Se in passato si utilizzava il prelievo venoso, oggi si stanno diffondendo tecniche alternative come i Dried Blood Spots (DBS), ovvero gocce di sangue essiccate su carta filtrante. I DBS offrono vantaggi pratici: facilità di raccolta, assenza di personale sanitario per il prelievo, semplicità di trasporto e conservazione. In questo studio è stata testata una nuova generazione di card DBS, le HemaXis DB10, che utilizzano solo 10 µL di sangue (contro i 30 µL delle tradizionali Whatman 903). I risultati hanno confermato che le prestazioni analitiche rimangono equivalenti. Le card HemaXis sono dotate di un innovativo sistema di microfluidica, che garantisce una distribuzione volumetrica controllata del sangue, riducendo la variabilità dovuta alla deposizione manuale. Dopo la verifica e semivalidazione del metodo, il protocollo è stato applicato a campioni reali di soggetti sani e pazienti affetti da disturbo bipolare, alcuni dei quali hanno dichiarato consumo di alcol. Lo studio ha così permesso di confrontare i livelli di PETh nei due gruppi e valutare possibili interazioni tra l’assunzione di alcol e i pathway metabolici alterati nel bipolarismo. I risultati suggeriscono che l’alcol possa aggravare tali squilibri, influenzando la risposta terapeutica e la stabilità dell’umore. Infine, è stata valutata l’affidabilità del sistema HemaXis confrontando il sangue capillare raccolto col device con il sangue venoso depositato con pipetta. È emersa una variabilità nei risultati capillari, potenzialmente legata all’ematocrito e al tempo di applicazione del dito sulla card. Saranno necessari studi futuri per approfondire questi fattori, definire un eventuale fattore di incertezza e migliorare la standardizzazione del prelievo. Questo studio conferma che la quantificazione del PETh nei DBS è affidabile, ma l’uso della microfluidica richiede ulteriori ottimizzazioni per garantire riproducibilità.
Sviluppo e semi-validazione di un metodo di microcampionamento quantitativo del tipo Dried Blood Spots per la determinazione del fosfatidiletanolo e applicazione su soggetti bipolari
CARNOVALE, MARTINA
2023/2024
Abstract
Il consumo di alcol, oltre a essere un fenomeno sociale e culturale, ha rilevanti implicazioni in ambito medico, legale e forense. La determinazione dell’assunzione di alcol è fondamentale per monitorare eventuali abusi. Oltre al classico dosaggio del tasso alcolemico (BAC), oggi sono disponibili biomarcatori più sensibili e con tempi di rilevamento più estesi. Tra questi, il fosfatidiletanolo (PETh) è uno dei più specifici e affidabili. Il PETh si forma nel sangue a seguito della reazione tra etanolo e fosfolipidi di membrana, rimanendo rilevabile per giorni o settimane dopo l’assunzione. Questo lo rende superiore ad altri marcatori come l’EtG, che ha una finestra di rilevamento più breve. L’analisi del PETh avviene mediante tecniche come HPLC e spettrometria di massa, garantendo elevata sensibilità. Il PETh ha applicazioni cliniche e forensi: consente di confermare il consumo di alcol, monitorare pazienti in trattamento e valutare dichiarazioni in ambito giudiziario o la recidiva nei programmi di riabilitazione. Se in passato si utilizzava il prelievo venoso, oggi si stanno diffondendo tecniche alternative come i Dried Blood Spots (DBS), ovvero gocce di sangue essiccate su carta filtrante. I DBS offrono vantaggi pratici: facilità di raccolta, assenza di personale sanitario per il prelievo, semplicità di trasporto e conservazione. In questo studio è stata testata una nuova generazione di card DBS, le HemaXis DB10, che utilizzano solo 10 µL di sangue (contro i 30 µL delle tradizionali Whatman 903). I risultati hanno confermato che le prestazioni analitiche rimangono equivalenti. Le card HemaXis sono dotate di un innovativo sistema di microfluidica, che garantisce una distribuzione volumetrica controllata del sangue, riducendo la variabilità dovuta alla deposizione manuale. Dopo la verifica e semivalidazione del metodo, il protocollo è stato applicato a campioni reali di soggetti sani e pazienti affetti da disturbo bipolare, alcuni dei quali hanno dichiarato consumo di alcol. Lo studio ha così permesso di confrontare i livelli di PETh nei due gruppi e valutare possibili interazioni tra l’assunzione di alcol e i pathway metabolici alterati nel bipolarismo. I risultati suggeriscono che l’alcol possa aggravare tali squilibri, influenzando la risposta terapeutica e la stabilità dell’umore. Infine, è stata valutata l’affidabilità del sistema HemaXis confrontando il sangue capillare raccolto col device con il sangue venoso depositato con pipetta. È emersa una variabilità nei risultati capillari, potenzialmente legata all’ematocrito e al tempo di applicazione del dito sulla card. Saranno necessari studi futuri per approfondire questi fattori, definire un eventuale fattore di incertezza e migliorare la standardizzazione del prelievo. Questo studio conferma che la quantificazione del PETh nei DBS è affidabile, ma l’uso della microfluidica richiede ulteriori ottimizzazioni per garantire riproducibilità.| File | Dimensione | Formato | |
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