La comunicazione chimica nei batteri: sviluppo di metodi basati sulla spettrometria di massa per la quantificazione di molecole QS in matrici biologiche e ambientali ​

Quorum sensing (QS) is an intercellular chemical communication mechanism that enables bacterial cells to regulate gene expression based on their population density. This process relies on signaling molecules, known as autoinducers (AIs), which are produced and released by bacteria into the extracellular environment. In Gram-negative bacteria, the main signaling molecules include N-acyl-homoserine lactones (AHLs) and autoinducer-2 (AI-2). This study aimed to develop advanced analytical methods based on liquid chromatography (LC) coupled with mass spectrometry (MS) for the quantification of QS molecules in biological and environmental samples. A HPLC-MS/MS method was optimized to identify and quantify 14 AHLs and one hydroxyquinolone (HQ) in plasma samples from septic patients. Multiple reaction monitoring (MRM) transitions were optimized through direct infusion; the developed method achieved limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) in plasma matrix ranging from 0.02 to 20.9 µg/L and 0.03 to 69.6 µg/L, respectively. exhibiting the highest average plasma concentration (4.70 µg/L). To the best of our knowledge, this represents the first study to simultaneously detect 14 AHLs and one HQ in a biological matrix, opening new perspectives for investigating QS mechanisms in clinical settings. Additionally, river water samples were analyzed using HPLC-HRMS combined with solid-phase extraction (SPE) to identify both known and unknown QS molecules, with the aim of gaining deeper insights into environmental processes involving bacteria, such as biofilm formation. The results confirmed the presence of QS molecules, including previously unidentified compounds such as C12:1-AHL. In conclusion, the developed HPLC-(HR)MS methods proved to be sensitive and selective, enabling the identification and quantification of 14 AHLs and one HQ in different matrices.

Il quorum sensing (QS) è un meccanismo di comunicazione chimica intercellulare che consente alle cellule batteriche di regolare l'espressione genica in funzione della loro densità cellulare. Questo processo si basa su molecole segnale, denominate autoinduttori (AI), prodotte e rilasciate dai batteri nell'ambiente extracellulare. Nei batteri Gram-negativi, le principali molecole di segnalazione includono N-acil-omoserina lattoni (AHL) e autoinduttori-2 (AI-2). Questo studio si è posto l'obiettivo di sviluppare metodiche analitiche avanzate, basate sulla cromatografia liquida (LC) accoppiata alla spettrometria di massa (MS), per la quantificazione di molecole QS in campioni biologici e ambientali. È stata ottimizzata una metodica HPLC-MS/MS per identificare e quantificare 14 AHLs e un idrossichinolone (HQ) in campioni plasmatici di pazienti settici. Le transizioni MRM sono state ottimizzate mediante infusione diretta; il metodo sviluppato ha raggiunto in matrice plasmatica limiti di rivelabilità (LOD) e quantificazione (LOQ) tra 0,02 e 20,9 µg/L e tra 0,03 e 69,6 µg/L, rispettivamente. Le molecole target sono state rilevate in tutti i campioni analizzati, con il N-dodecanoil-omoserina lattone che ha mostrato le concentrazioni plasmatiche medie più elevate (4,70 µg/L). Questo rappresenta, secondo le attuali conoscenze, il primo studio a rilevare simultaneamente 14 AHL e un HQ in matrice biologica, aprendo nuove prospettive per l'analisi dei meccanismi QS in ambito clinico. Contestualmente, campioni di acqua fluviale sono stati analizzati mediante HPLC-HRMS in combinazione con estrazione in fase solida (SPE) per l’identificazione di molecole QS note e incognite al fine di comprendere maggiormente i processi ambientali in cui i batteri sono coinvolti, come la formazione di biofilm. I risultati hanno confermato la presenza di molecole QS in aggiunta a quelle note, come per esempio il C12:1-AHL. In conclusione, i metodi HPLC-(HR)MS sviluppati si sono rivelati sensibili e selettivi per permettere l’identificazione e la quantificazione di 14 AHL e un HQ in matrici di diversa origine.