Background: Chimeric antigen receptor T-cell (CAR-T) therapy represents a groundbreaking advancement in the treatment of hematologic malignancies. However, cytokine release syndrome (CRS), immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome (ICANS), and prolonged cytopenia are common adverse effects, lacking specific diagnostic/predictive markers. Extracellular vesicles (EVs) can be studied to assess cellular stress, while endothelial progenitor cells (EPCs), essential for vascular repair, and circulating endothelial cells (CECs) serve as indicators of endothelial complications. Objectives: To investigate the role of EVs, CECs, and EPCs as predictive and diagnostic biomarkers of post-CAR-T complications. Methods: Between 10/2023 and 12/2024, serum samples were collected from 21 patients (median age: 64 years) and analyzed before lymphodepletion (LD, the preparatory therapy prior to infusion) and at 0 (infusion), 1, 3, 7, 10, 14, and 20/30 days. EPCs and CECs were analyzed via multiparametric flow cytometry (MFC) using CD34, CD309, CD31, CD14, CD45, CD133, CD146, and CD36 markers. EVs were characterized without pre-analytical enrichment using a standardized MFC antibody panel (Phalloidin, LCD, CD41a, CD31, CD45, CD146) to identify leukocyte-derived (LK), endothelial (EC), and platelet-derived EVs, further distinguishing between those originating from activated ECs and LKs. The absolute EV count was performed using Trucount BDTM, and immunophenotyping was conducted with the MACSPlex EV IO kit, distinguishing 37 membrane markers among exosomes, microvesicles, and CD144+/CD146+ EVs. Statistical analysis, conducted using R, employed the Mann-Whitney and Kruskal-Wallis tests for group comparisons and ROC curves for predictive capability assessment. Results: Among the 21 patients, 14 had diffuse large B-cell lymphoma, 4 had follicular lymphoma, and 3 had mantle cell lymphoma. CRS occurred in 17/21 patients (16 grade 1, 1 grade 2), while 6 experienced grade 1 ICANS. Prolonged cytopenia was observed in 13/21 patients. LD and CAR-T infusion significantly affected the endothelium, with a progressive increase in CECs and EPCs peaking on day +10. Pre-LD levels of CD146+ leukocyte EVs were predictive of CRS and ICANS (AUC 0.897 and 0.778), while CD14+ EVs emerged as a biomarker for ICANS (p<0.05). High levels of total EVs, CD146+ EVs, and leukocyte-derived EVs could predict prolonged cytopenia (AUC 0.813, 0.803, and 0.764). EPCs remained low in patients with late-onset cytopenia and increased in those who did not develop it, showing a trend at LD (p ns). Discussion: CAR-T therapy is associated with predictable toxicities, which in our cohort align with the literature. Early use of Tocilizumab and steroids improved the management of CRS and ICANS, reducing severe toxicity. We identified potentially predictive biomarkers: high pre-LD levels of CD146+ leukocyte EVs correlated with CRS/ICANS, while total EVs, CD146+ EVs, and leukocyte EVs may predict the risk of prolonged cytopenia. Moreover, CD14+ EV levels correlated with ICANS, supporting a role for monocyte/macrophage activation in neurotoxicity. The correlation between EPCs and bone marrow recovery suggests that a defect in the angiogenic response may contribute to prolonged cytopenia. These preliminary findings open new perspectives for monitoring and managing post-CAR-T complications.
Introduzione: La terapia con cellule T del recettore antigenico chimerico (CAR-T) è un progresso rivoluzionario nel trattamento delle neoplasie ematologiche. Tuttavia, la sindrome da rilascio di citochine (CRS), la sindrome da neurotossicità associata alle cellule effettrici immunitarie (ICANS) e la citopenia prolungata sono effetti avversi comuni, privi di marcatori diagnostici/predittivi specifici. Le vescicole extracellulari (EVs) possono essere studiate per valutare lo stress cellulare; mentre le cellule progenitrici endoteliali (EPCs), essenziali per la riparazione vascolare, e le cellule endoteliali circolanti (CECs), segnalano complicanze endoteliali. Obiettivi: Indagare il ruolo di EVs, CECs ed EPCs come biomarcatori predittivi e diagnostici delle complicanze post-CAR-T. Metodi: Tra 10/2023 e 12/2024 sono stati raccolti i sieri di 21 pazienti studiati prima della linfodeplezione (LD, terapia preparatoria all’infusione) e a 0 (infusione), 1, 3, 7, 10, 14 e 20/30 giorni. EPCs e CECs sono state analizzate con citometria a flusso multiparametrica utilizzando i marcatori CD34, CD309, CD31, CD14, CD45, CD133, CD146 e CD36. Le EVs sono state caratterizzate senza arricchimento pre-analitico con un pannello standardizzato di anticorpi MFC (Phalloidina, LCD, CD41a, CD31, CD45, CD146) per identificare EVs leucocitarie (LK), endoteliali (EC) e piastriniche, distinguendo inoltre l’origine da EC e LK attivati. Il conteggio assoluto delle EVs è stato effettuato con il Trucount BDTM e l’immunofenotipo con il kit MACSPlex EV IO, che distingue 37 marcatori di membrana tra esosomi, microvescicole ed EVs CD144+/CD146+. L'analisi statistica, condotta con R, ha utilizzato i test di Mann-Whitney e Kruskal-Wallis per il confronto tra gruppi e curve ROC per la capacità predittiva. Risultati: Quattordici dei 21 pazienti avevano linfoma diffuso a grandi cellule B, 4 linfoma follicolare, 3 linfoma mantellare. La CRS è stata osservata in 17/21 pazienti (16 grado 1, 1 grado 2), mentre 6 hanno avuto ICANS di grado 1. La citopenia prolungata si è verificata in 13/21 pazienti. La LD e l’infusione di CAR-T hanno effettivamente influenzato l’endotelio, con un progressivo aumento di CECs ed EPCs fino al picco al giorno +10. I livelli pre-LD di Leuco EVs CD146+ sono risultati predittivi di CRS e ICANS (25,6 vs 64,4, AUC 0,897, p=,016 e 29,9 vs 74,9, AUC 0,778, p=,05, rispettivamente), mentre CD14+ EVs emerge come biomarcatore di ICANS (p<0,05). Elevati livelli di EVs totali, EVs CD146+ e EVs leucocitarie potrebbero predire la citopenia prolungata (p=,05: 11717 vs 23554 AUC 0,813, 923 vs 4146 AUC 0,803 e 175 vs 346 AUC 0,764, rispettivamente). Le EPCs restano basse nei pazienti con citopenia tardiva e aumentano in chi non la sviluppa, mostrando un trend alla LD (p ns). Discussione: La terapia CAR-T è associata a tossicità prevedibili, nella nostra casistica coerenti con i dati di letteratura. L’uso precoce di Tocilizumab e steroidi ha migliorato la gestione di CRS e ICANS, riducendo la tossicità severa. Abbiamo identificato biomarcatori potenzialmente predittivi: alti livelli pre-LD di Leuco EVs CD146+ correlano con CRS/ICANS, mentre EVs totali, EVs CD146+ e EVs leucocitarie potrebbero predire il rischio di citopenie prolungate. Infine, i livelli di CD14+ EVs correlano con ICANS, supportando un ruolo dell’attivazione monocitaria/macrofagica nella neurotossicità. La correlazione tra EPCs e recupero midollare indica che un difetto nella risposta angiogenica potrebbe favorire la citopenia prolungata. Questi risultati preliminari aprono nuove prospettive per il monitoraggio e la gestione delle complicanze post-CAR-T.
Il ruolo delle vescicole extracellulari e delle cellule endoteliali come biomarcatori nella terapia cellulare con CAR-T
OCCELLI, MARTINA
2024/2025
Abstract
Introduzione: La terapia con cellule T del recettore antigenico chimerico (CAR-T) è un progresso rivoluzionario nel trattamento delle neoplasie ematologiche. Tuttavia, la sindrome da rilascio di citochine (CRS), la sindrome da neurotossicità associata alle cellule effettrici immunitarie (ICANS) e la citopenia prolungata sono effetti avversi comuni, privi di marcatori diagnostici/predittivi specifici. Le vescicole extracellulari (EVs) possono essere studiate per valutare lo stress cellulare; mentre le cellule progenitrici endoteliali (EPCs), essenziali per la riparazione vascolare, e le cellule endoteliali circolanti (CECs), segnalano complicanze endoteliali. Obiettivi: Indagare il ruolo di EVs, CECs ed EPCs come biomarcatori predittivi e diagnostici delle complicanze post-CAR-T. Metodi: Tra 10/2023 e 12/2024 sono stati raccolti i sieri di 21 pazienti studiati prima della linfodeplezione (LD, terapia preparatoria all’infusione) e a 0 (infusione), 1, 3, 7, 10, 14 e 20/30 giorni. EPCs e CECs sono state analizzate con citometria a flusso multiparametrica utilizzando i marcatori CD34, CD309, CD31, CD14, CD45, CD133, CD146 e CD36. Le EVs sono state caratterizzate senza arricchimento pre-analitico con un pannello standardizzato di anticorpi MFC (Phalloidina, LCD, CD41a, CD31, CD45, CD146) per identificare EVs leucocitarie (LK), endoteliali (EC) e piastriniche, distinguendo inoltre l’origine da EC e LK attivati. Il conteggio assoluto delle EVs è stato effettuato con il Trucount BDTM e l’immunofenotipo con il kit MACSPlex EV IO, che distingue 37 marcatori di membrana tra esosomi, microvescicole ed EVs CD144+/CD146+. L'analisi statistica, condotta con R, ha utilizzato i test di Mann-Whitney e Kruskal-Wallis per il confronto tra gruppi e curve ROC per la capacità predittiva. Risultati: Quattordici dei 21 pazienti avevano linfoma diffuso a grandi cellule B, 4 linfoma follicolare, 3 linfoma mantellare. La CRS è stata osservata in 17/21 pazienti (16 grado 1, 1 grado 2), mentre 6 hanno avuto ICANS di grado 1. La citopenia prolungata si è verificata in 13/21 pazienti. La LD e l’infusione di CAR-T hanno effettivamente influenzato l’endotelio, con un progressivo aumento di CECs ed EPCs fino al picco al giorno +10. I livelli pre-LD di Leuco EVs CD146+ sono risultati predittivi di CRS e ICANS (25,6 vs 64,4, AUC 0,897, p=,016 e 29,9 vs 74,9, AUC 0,778, p=,05, rispettivamente), mentre CD14+ EVs emerge come biomarcatore di ICANS (p<0,05). Elevati livelli di EVs totali, EVs CD146+ e EVs leucocitarie potrebbero predire la citopenia prolungata (p=,05: 11717 vs 23554 AUC 0,813, 923 vs 4146 AUC 0,803 e 175 vs 346 AUC 0,764, rispettivamente). Le EPCs restano basse nei pazienti con citopenia tardiva e aumentano in chi non la sviluppa, mostrando un trend alla LD (p ns). Discussione: La terapia CAR-T è associata a tossicità prevedibili, nella nostra casistica coerenti con i dati di letteratura. L’uso precoce di Tocilizumab e steroidi ha migliorato la gestione di CRS e ICANS, riducendo la tossicità severa. Abbiamo identificato biomarcatori potenzialmente predittivi: alti livelli pre-LD di Leuco EVs CD146+ correlano con CRS/ICANS, mentre EVs totali, EVs CD146+ e EVs leucocitarie potrebbero predire il rischio di citopenie prolungate. Infine, i livelli di CD14+ EVs correlano con ICANS, supportando un ruolo dell’attivazione monocitaria/macrofagica nella neurotossicità. La correlazione tra EPCs e recupero midollare indica che un difetto nella risposta angiogenica potrebbe favorire la citopenia prolungata. Questi risultati preliminari aprono nuove prospettive per il monitoraggio e la gestione delle complicanze post-CAR-T.| File | Dimensione | Formato | |
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