Caratterizzazione molecolare dei pazienti italiani con Anemia di Blackfan-Diamond

Background Diamond Blackfan anaemia (DBA) is a syndrome characterised by hyporigenerative anaemia associated with malformations and increased risk of malignancies. Penetrance is incomplete and expressivity variable. The majority of DBA patients carry haploinsufficient mutations in 1 of several ribosomal protein (RP)genes, Mutations in one of these genes are identified in 70% of DBA patients. Objectives The aim of the study is the molecular characterisation of the Italian patients included in the ‘Multicentric Retrospective Observational Study on Blackfan-Diamond Anaemia’ with particular focus on the search for deletions using the MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) method developed with probes on minor genes. Patients and methods 305 patients included in the Italian DBA Registry from 49 Centres of the Italian Association of Paediatric Haematology and Oncology (AIEOP) were selected. 97% (296/305) of these were characterised at the molecular level. The search for mutations was performed on peripheral blood samples with a multi-step approach combining NGS (Next Generation Sequencing), Sanger sequencing and the search for deletions and duplications by MLPA. Specifically with MLPA, 13 known disease-causing genes were analysed, including RPS19, RPL5, RPL11, RPS26, RPS17, which are genes most frequently involved. In addition, a new MLPA kit was developed in our laboratory, which includes 14 probes on the genes RPS7, RPS10, RPS24, RPS29, RPL15, RPL26, RPL31, RPL35, which are considered minor genes associated with DBA. Results Causal variants involving genes coding for RP of the minor and major subunits were identified in 74% of cases in varying proportions (66% and 34%, respectively). The observed mutations are mainly represented by single base change (missense mutation, splice-site change, nonsense mutation, small insertions/deletions). 20% of mutations are caused by partial gene duplications and gene deletions (partial or complete) detected by MLPA. The genes with the highest percentage of deletions are RPS7, RPS17 and RPL35A. In particular, the use of the home-made kit allowed us to identify 5 pts with a deletion in RPS7 that had not previously been mutated in our cohort. Discussion Our cohort is one of the largest in Europe with an almost complete molecular characterisation of the included patients. In 74% (219/296) of cases, a pathogenic molecular alteration was identified by combining different technologies including NGS, Sanger and MLPA. In particular, when analysing the type of molecular defect, the contribution of partial or complete deletions of the various RP genes was particularly high for this disease, with a predilection for some of them. Paying more attention to the RPS7 gene, it was possible to observe that in the Italian register 100% of the mutations involving it are deletions, a discrepancy with the data in the literature, underlining how fundamental it is to use methods aimed at finding these alterations, especially for some of these RP genes. Future prospects include the expansion of the cohort and the creation of MLPA kits containing new probes to detect further deletions.

Background L'anemia di Diamond Blackfan (DBA) è una sindrome caratterizzata da anemia iporigenerativa associata a malformazioni e rischio aumentato di neoplasie maligne. La penetranza è incompleta e l’espressività variabile. Il meccanismo patogenetico si basa sulla compromissione della sintesi proteica dovuta a mutazioni di geni che codificano per proteine ribosomiali (RP). Nel 70% dei pazienti DBA sono identificate mutazioni a carico di uno di questi geni. Obiettivo Obiettivo dello studio è la caratterizzazione molecolare dei pazienti italiani inclusi nello “Studio Osservazionale Retrospettivo-Prospettico Multicentrico sulla Anemia di Blackfan-Diamond” con particolare focus sulla ricerca di delezioni mediante l’utilizzo della metodica MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) messa a punto con sonde su geni minori. Pazienti e metodi Sono stati arruolati 305 pazienti inclusi nel Registro Italiano DBA da parte di 49 Centri dell’Associazione Italiana di Ematologia e Oncologia Pediatrica (AIEOP). Il 97% (296/305) di questi sono stati caratterizzati a livello molecolare. La ricerca delle mutazioni è stata eseguita su campioni di sangue periferico con un approccio in più fasi che combina NGS (Next Generation Sequencing), sequenziamento secondo Sanger e la ricerca di delezioni e duplicazioni mediante MLPA. In particolare con MLPA, sono stati analizzati 13 geni noti causanti patologia, tra cui RPS19, RPL5, RPL11, RPS26, RPS17 che sono geni coinvolti con maggior frequenza, in aggiunta, presso il nostro laboratorio è stato messo a punto un nuovo kit MLPA che include 14 sonde sui geni RPS7, RPS10, RPS24, RPS29, RPL15, RPL26, RPL31, RPL35, considerati geni minori associati alla DBA. Risultati Nel 74% dei casi sono state identificate varianti causali coinvolgendo geni che codificano per RP delle subunità minore e maggiore in proporzione variabile (rispettivamente 66% e 34%). Le mutazioni osservate sono rappresentate principalmente dal cambiamento di una singola base (mutazione missenso, splice-site change, mutazione nonsenso, piccole inserzioni/delezioni). Il 20% delle mutazioni è causata da duplicazioni geniche parziali e delezioni geniche (parziali o complete) rilevate dall'MLPA. I geni che presentano la più alta percentuale di delezioni sono RPS7, RPS17 ed RPL35A, in particolare l’utilizzo del kit home made ha permesso di identificare 5 pz con delezione in RPS7 non risultato mutato precedentemente nella nostra coorte. Discussione La nostra coorte è una delle più ampie a livello europeo con una quasi totale caratterizzazione molecolare dei pazienti inclusi. Nel 74% (219/296) dei casi è stata identificata una alterazione molecolare patogenetica combinando diverse tecnologie che includono NGS, Sanger e MLPA. In particolare, analizzando la tipologia di difetto molecolare risulta particolarmente elevato per questa patologia il contributo di delezioni parziali o complete dei diversi geni RP con predilezione per alcuni di loro. Ponendo maggior attenzione al gene RPS7, è stato possibile osservare come nel registro italiano il 100% delle mutazioni che lo coinvolgono siano costituite da delezioni, dato discrepante rispetto ai dati di letteratura a sottolineare come sia fondamentale utilizzare metodiche finalizzate alla ricerca di tali alterazioni specie per alcuni di questi geni RP. Le prospettive future prevedono l’ampliamento della coorte e la creazione di kit MLPA contenenti nuove sonde al fine di rilevare ulteriori delezioni.