Espressione e purificazione dell’enzima steroidogenico 17β-idrossisteroide deidrogenasi di tipo 7 (HSD17B7) di mammifero

A potential therapeutic target of great interest for the treatment of some hormone-sensitive tumors is the enzyme 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 7 (17β-HSD7), which belongs to the short-chain dehydrogenase/reductase (SDR) superfamily. These enzymes catalyze the NAD(P)(H)-dependent redox reactions of hydroxy/keto groups at the 17β position on steroid structures. They play a crucial role in several biosynthetic pathways, particularly in cholesterol biosynthesis and in the activation/inactivation processes of sex hormones, significantly influencing the mechanisms regulated by them, whose imbalance may contribute to the development of certain cancers. Regarding the sex hormone pathway, 17β-HSD7 exhibits dual catalytic activity: 17β-ketosteroid reductase activity, responsible for the conversion of estrone into its derivative 17β-estradiol by reducing the ketone group at C-17 to a hydroxyl group, and 3β-ketosteroid reductase activity, responsible for converting the substrates dihydrotestosterone (DHT), progesterone, and 20α-hydroxyprogesterone into 5α-androstane-3β,17β-diol (3βA-diol), 4-pregnen-3β-ol-20-one, and 4-pregnen-3β,20α-diol, respectively, by reducing the ketone group at C-3 to a hydroxyl group. The second catalytic activity is also responsible for the reduction of (4-methyl)zymosterone to (4-methyl)zymosterol in the cholesterol biosynthetic pathway. To date, fifteen enzymatic isoforms of this family have been identified, but only seven have been characterized. The three-dimensional structure of HSD17B7 remains unknown due to its low solubility and difficulty in purification. The primary aim of this thesis project was to develop a purification protocol for the mammalian enzyme HSD17B7 (HsHSD17B7 and MmHSD17B7) for subsequent biochemical and enzymatic characterization studies. The first phase of the project involved expression trials in E. coli cells. Subsequently, solubility tests were conducted under different conditions using various buffers, detergents, and nanodiscs to enhance enzyme solubility and optimize purification. Finally, the estrone-reductase and zymosterone-reductase activities of the purified recombinant proteins were tested in vitro.

Un potenziale bersaglio terapeutico di grande interesse per il trattamento di alcune forme tumorali ormone-sensibili è l’enzima β-idrossisteroide deidrogenasi di tipo 7 (17β-HSD7), che appartiene alla superfamiglia delle deidrogenasi/reduttasi (SDRs) a corta catena. Si tratta di enzimi che catalizzano l’ossidoriduzione NAD(P)(H) -dipendente di idrossi/cheto-gruppi in posizione 17β su strutture di natura steroidea. Rivestono un ruolo cruciale in numerose vie biosintetiche, in particolare nella biosintesi del colesterolo e nei processi di attivazione e inattivazione degli ormoni sessuali, esercitando un’influenza significativa sui meccanismi da essi regolati, il cui squilibrio può contribuire allo sviluppo di forme tumorali. Per quanto riguarda il pathway degli ormoni sessuali, 17β-HSD7 presenta una doppia attività catalitica: attività 17β-chetosteroide reduttasica, responsabile della conversione dell’estrone nel derivato 17β- estradiolo tramite la riduzione del gruppo chetonico in C-17 a gruppo ossidrilico e attività 3β-chetosteroide reduttasica, responsabile della conversione dei substrati diidrotestosterone (DHT), progesterone e 20α-idrossiprogesterone rispettivamente in 5α-androstan-3β,17β-diolo (3βA-diolo), 4-pregnen-3β-ol-20-one e 4-pregnen-3β,20α-diolo tramite la riduzione del gruppo chetonico in C-3 a gruppo ossidrilico. La seconda attività catalitica è anche responsabile della riduzione del (4-metil)zimosterone in (4-metil)zimosterolo nella via biosintetica del colesterolo. Ad oggi sono note quindici isoforme enzimatiche appartenenti a questa famiglia, di cui solo sette sono state caratterizzate, mentre non è nota la struttura tridimensionale di HSD17B7, perché risulta scarsamente solubile e difficilmente purificabile. L’ obiettivo principale di questo progetto di tesi è stato la messa a punto di un protocollo di purificazione dell’enzima HSD17B7 di mammifero (HsHSD17B7 e MmHSD17B7) per successivi studi di caratterizzazione biochimica ed enzimatica. La prima fase del progetto ha riguardato prove di espressione in cellule di E. coli. Successivamente, sono state condotte prove di solubilità in condizioni differenti, utilizzando diversi tamponi, detergenti e tramite l’impiego di nanodischi, al fine di incrementare la solubilità dell’enzima ed ottimizzare la purificazione. In ultima analisi, è stata testata in vitro l’attività estrone-reduttasica e zimosterone-reduttasica delle proteine ricombinanti purificate.