Purificazione e studi di inibizione di Aldo-cheto reduttasi (AKR1Cs) coinvolte nella patogenesi del carcinoma prostatico castrazione resistente

Prostate carcinoma is one of the most common cancers in the human male population. In some patients, the disease evolves to an advanced and metastatic stage, which is treated with the androgen deprivation therapy (ADT, or "castration therapy") and/or radiotherapy. However, after a phase of tumor remission, many patients develop a more aggressive variant of the disease, known as castration-resistant prostate cancer (CRPC). CRPC is characterized by a poor prognosis and an average survival of 18 months. The emergence of resistance has been associated with several factors, including the overexpression of the Aldo-Keto Reductase 1C3 (AKR1C3). Acting as a 17-ketosteroid reductase, AKR1C3 is involved in the intratumoral synthesis of testosterone (T) and dihydrotestosterone (DHT), both potent activators of the androgen receptors and key drivers of carcinoma progression. Therefore, AKR1C3 inhibitors represent potential therapeutic agents for the treatment of CRPC. In addition to AKR1C3, two other isoforms of the same enzymatic family, AKR1C1 and AKR1C2, play a crucial role in CRPC pathogenesis. Both enzymes participate in the DHT inactivation, and their inhibition leads to an increased tumor proliferation. Consequently, developing molecules capable of selectively inhibit AKR1C3 without affecting AKR1C2 and AKR1C1 is of fundamental importance to ensure an effective treatment. Although numerous selective AKR1C3 inhibitors have been reported in literature, no compound has yet been approved for clinical use. Therefore, designing and developing new active and selective molecules to be used in clinical trials is of crucial importance. The main objective of this thesis is to identify novel potent and selective AKR1C3 inhibitors. We conducted enzymatic inhibition test in vitro based on a fluorescence assays on the purified recombinant AKR1C3 enzyme using a series of synthetic piperazine-based molecules obtained thanks to the collaboration with the MedSynth group of the Department of Drug Science and Technology (University of Turin) and the Department of Organic and Pharmaceutical Chemistry of the University of Seville. To assess the selectivity of the most active molecules, we developed a protocol for the expression of AKR1C1 (which was not yet available in the laboratory, unlike the AKR1C2 isoform) in Escherichia coli and its subsequent purification. Fourteen potential inhibitors of the recombinant enzyme AKR1C3 were tested; of these, only four showed a promising inhibition profile. Therefore, they were also tested on AKR1C1 and AKR1C2 to assess their selectivity.

Il carcinoma prostatico rappresenta una delle neoplasie più diffuse nella popolazione maschile. In alcuni pazienti la patologia progredisce verso uno stadio avanzato e metastatico, trattato attraverso la terapia di deprivazione androgenica (ADT, o "terapia di castrazione") e/o radioterapia. Tuttavia, dopo una fase di remissione tumorale, molti pazienti sviluppano una variante più aggressiva della patologia, nota come carcinoma prostatico resistente alla castrazione (CRPC), caratterizzata da una prognosi sfavorevole e da una sopravvivenza media di circa 18 mesi. L'insorgenza della resistenza è stata associata a diversi fattori, tra cui la sovraespressione dell’enzima Aldochetoreduttasi 1C3 (AKR1C3). Agendo come una 17-chetosteroide reduttasi, AKR1C3 è implicato nella sintesi intratumorale degli androgeni testosterone (T) e diidrotestosterone (DHT), potenti attivatori del recettore degli androgeni e responsabili della progressione del carcinoma. Pertanto, gli inibitori di AKR1C3 rappresentano potenziali agenti terapeutici per il trattamento del CRPC. Oltre a AKR1C3, altre due isoforme della stessa famiglia enzimatica, AKR1C1 e AKR1C2, rivestono un ruolo chiave nella patogenesi del CRPC. Entrambe sono coinvolte nell’inattivazione del DHT e la loro inibizione determina, in questo caso, un aumento della proliferazione tumorale. Pertanto, lo sviluppo di molecole in grado di inibire selettivamente AKR1C3 e non AKR1C2 e AKR1C1 è di fondamentale importanza per garantire un trattamento efficace del CRPC. Sebbene in letteratura siano riportati numerosi inibitori selettivi di AKR1C3, ad oggi nessun composto è stato approvato per l’uso clinico. Riveste quindi un ruolo cruciale progettare e sviluppare nuove molecole attive e selettive da portare in sperimentazione clinica. L'obiettivo principale di questo progetto di tesi è stato quello di identificare nuovi inibitori potenti e selettivi di AKR1C3. A tal fine, sono stati condotti test in vitro di inibizione enzimatica basati su un metodo fluorimetrico sull’enzima ricombinante purificato AKR1C3 utilizzando una serie di molecole di sintesi a struttura piperazinica ottenuti grazie alla collaborazione con il gruppo MedSynth del Dipartimento di Scienza e Tecnologia del Farmaco (Università degli studi di Torino) e con il Dipartimento di Chimica Organica e Farmaceutica dell’ Università di Siviglia. Parallelamente, è stato messo a punto un protocollo per l’espressione in Escherichia Coli e la successiva purificazione della proteina ricombinante AKR1C1 (non ancora disponibile in laboratorio, a differenza della isoforma AKR1C2), al fine di valutare la selettività delle molecole più attive. Sono stati testati 14 potenziali inibitori dell’enzima ricombinante AKR1C3, di questi solo 4 hanno mostrato un profilo di inibizione promettente. Pertanto sono stati testati anche su AKR1C1 e AKR1C2 per valutarne la selettività.