Un nuovo metodo in LC-MS/MS per la determinazione sierica di cortisolo, cortisone e desametasone: utilità nell’interpretazione del test di soppressione con desametasone a bassa dose

Background: The low-dose dexamethasone suppression test (DST) is one of the first-line tests in the suspicion of hypercortisolism, and its interpretation can be influenced by the correct intake/bioavailability of dexamethasone (DEX). The new assays using liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS) provide more accurate results, especially for low steroid values (as in the case of cortisol after DST), and allow for the simultaneous assessment of multiple steroids. However, the literature does not clearly define: the clinical impact of DEX after DST on test interpretation, the factors that may influence DEX levels after DST, and the cut-off values of cortisol (F) and cortisone (E), measured via LC-MS/MS, for the diagnosis of hypercortisolism. The aim of this study is to apply a new LC-MS/MS method for the quantification of F, E, and DEX to assess DST adequacy and to derive the cut-off values of F and E after DST for the diagnosis of hypercortisolism. Subjects and Methods: Clinical data and patient samples were collected during the execution of the DST at the Day Service of the Division of Endocrinology, Diabetes, and Metabolism of the A.O.U. Città della Salute e della Scienza di Torino, from 05/2022 to 10/2024. The concentration of F after DST was initially measured using the chemiluminescent immunoassay (CLIA) method and subsequently, F, E, and DEX were determined on the same sample using LC-MS/MS. The diagnosis of hypercortisolism was established through the DST performed with the CLIA method. Results: A total of 416 patients was included (M/F: 146/270, age 52.9±18.5 years). The 7.1% were diagnosed with overt hypercortisolism (N=29), 25.8% with MACS (Mild Autonomous Cortisol Secretion, N=107), 32.9% with NFAI (Non-Functioning Adrenal Incidentaloma, N=137), and 34.2% had no pituitary or adrenal pathology (N=143). A comparison of the main features among the different diagnostic groups revealed significant differences in weight, BMI, and obesity. The metabolic-hypertensive profile was more compromised in patients with hypercortisolism, who showed higher blood glucose and blood pressure levels, as well as a greater prevalence of diabetes mellitus and increased use of antihypertensive and antihyperlipidemic drugs. Additionally, these patients had a reduction in glomerular filtration rate. DEX levels did not differ among the diagnostic groups (p<0.914). The 2.5⁰ percentile of DEX concentration across all DSTs was 1.25 ng/mL, while for negative DSTs, it was 1.31 ng/mL. Among the ten patients below this cut-off, three were diagnosed with hypercortisolism, one was taking combined oral contraceptive pill, and the remaining six exhibited a correct suppression of cortisol after DST. Considering the F cut-off in CLIA after DST as the gold standard for defining test positivity, F and E measured by LC-MS/MS after DST showed comparable accuracy (F-MS cut-off: 20.32 ng/mL, AUC 0.970; E-MS cut-off: 4.1 ng/mL, AUC 0.945). In predicting the final diagnosis of hypercortisolism, all three analytes demonstrated comparable accuracy (F-CLIA AUC: 0.933; F-MS cut-off: 23.49 ng/mL, AUC 0.928; E-MS cut-off: 4.53 ng/mL, AUC 0.923), while considering the limit that the final diagnosis was established based on the F value after DST in CLIA. Conclusions: The application of this new LC-MS/MS method for the determination of F, E, and DEX has demonstrated that the test is reliable even at minimally detectable DEX levels and that it exhibits high accuracy, particularly when using LC-MS/MS. The cut-off values of F after DST for defining test positivity and diagnosing hypercortisolism were found to be slightly higher than the well-established F-CLIA cut-off, while the corresponding cut-off values for E after DST were defined de novo.

Introduzione: Il test di soppressione con desametasone a bassa dose (DST) è uno dei test di primo livello nel sospetto di ipercortisolismo e la sua interpretazione può essere influenzata dalla biodisponibilità del desametasone (DEX). I nuovi dosaggi in cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS), forniscono risultati più accurati, soprattutto per valori ridotti di steroidi e permettono di valutare contestualmente più analiti steroidei. Tuttavia, in letteratura non è chiaro: l’impatto clinico del DEX dopo DST nell’interpretazione del test, da cosa il valore di DEX dopo DST possa essere influenzato e quali siano i cut-off di cortisolo (F) e cortisone (E), dosati in LC-MS/MS, per la diagnosi d’ipercortisolismo. L’obiettivo di questo studio è applicare un nuovo metodo per il dosaggio in LC-MS/MS di F, E e DEX che permetta di valutare l’adeguatezza del DST e derivare i cut-off di F ed E dopo DST per la diagnosi d'ipercortisolismo. Soggetti e metodi: Sono stati raccolti i dati clinici e i campioni dei pazienti durante l’esecuzione del DST presso il Day Service di Endocrinologia, Diabetologia e Metabolismo dell'A.O.U. Città della Salute e della Scienza di Torino, da 05/2022 a 10/2024. La concentrazione di F dopo DST è stata dapprima misurata con la metodica immunochimica (CLIA) e successivamente tramite LC-MS/MS, sono stati determinati F, E e DEX sul medesimo campione. La diagnosi d’ipercortisolismo è stata formulata sulla base del DST con la metodica CLIA in associazione agli altri test indicati dalle Linee Guida. Risultati: Sono stati inclusi 416 pazienti (M/F: 146/270, età 52.9±18.5 anni). Il 7.1% di questi è risultato affetto da ipercortisolismo overt (N=29), il 25.8% da MACS (Mild Autonomous Cortisol Secretion, N=107), il 32.9% da NFAI (Non Functioning Adrenal Incidentaloma, N=137) e il 34.2% non affetti da patologia ipofisaria o surrenalica (N=143). Il confronto delle principali caratteristiche nei gruppi diagnostici mostra differenze significative per quanto riguarda peso, BMI, ed obesità. Il profilo metabolico-ipertensivo risulta più compromesso nei pazienti con ipercortisolismo, che presentano valori di glicemia e pressione arteriosa più elevati, e una maggiore presenza di diabete mellito e una maggiore assunzione di farmaci antipertensivi e antidislipidemici. Inoltre, in questi soggetti, si osserva una riduzione della velocità di filtrazione glomerulare. I valori di DEX non sono risultati differenti nei diversi gruppi (p<0.914). Il 2.5° percentile della concentrazione di DEX di tutti i DST è risultato 1.25 ng/mL, mentre dei DST negativi 1.31 ng/mL. Dei dieci pazienti al di sotto di questo cut-off, tre sono risultati affetti da ipercortisolismo, una era in terapia con estroprogestinici e gli ultimi sei soggetti presentavano corretta inibizione al DST. Considerando il cut-off di F in CLIA dopo DST come gold standard per definire la positività al test, F ed E in LC-MS/MS dopo DST hanno mostrato un’accuratezza paragonabile (F-MS cut-off 20.32 ng/mL, AUC 0.970; E-MS: cut-off 4.1 ng/mL, AUC 0.945). Nella predizione della diagnosi finale di ipercortisolismo, i tre analiti hanno mostrato un’accuratezza comparabile (F-CLIA AUC 0.933; F-MS: cut-off 23.49 ng/mL, AUC 0.928; E-MS: cut-off 4.53 ng/mL, AUC 0.923), tenendo però in considerazione il limite che la diagnosi finale fosse stata posta sulla base del valore di F dopo DST in CLIA. Conclusioni: L’impiego del nuovo metodo in LC-MS/MS per la determinazione di F, E e DEX ha mostrato come il test sia attendibile già per valori di DEX appena dosabili e come il test sia altamente accurato, soprattutto in LC-MS/MS. I cut-off di F dopo DST per la positività del test e per la diagnosi di ipercortisolismo sono risultati leggermente superiori al noto cut-off di F-CLIA, mentre sono stati definiti de novo i cut-off di E dopo DST.