Espressione e purificazione dell'enzima steroidogenico 17β-idrossisteroide deidrogenasi di tipo 7 (HSD17B7) di origine fungina

The 17β-hydroxysteroid dehydrogenase (HSD17B) family consists of 15 enzymatic isoforms (from HSD17B1 to HSD17B15). To date, only seven have been characterized, and the three-dimensional structure of HSD17B7 is still unknown, as it is a poorly soluble and difficult-to-purify protein. The latter can be considered a potential therapeutic target of great interest for the treatment of certain tumor forms hormone-sensitive as it is involved in the regulation of the metabolism of estradiol and estrone, as well as breast cancers that are positive for oestrogen receptors and ovarian tumors. HSD17B7 has two main catalytic activities: the 17β-Ketosteroid reductase responsible for converting estrone to 17β-estradiol, and the 3β-chetosteroid reductase acting in reducing (4-methyl)zimosterone into (4-methyl)zimosterol in the biosynthesis of cholesterol. Preliminary studies showed that Erg27p of Saccharomyces cerevisiae, the human HSD17B7 orthologous enzyme, does not possess the reductatic activity of steroid hormones but only the reductatic activity of intermediates in cholesterol synthesis. Both activities are present in the human and murine HSD17B7, as demonstrated by a parallel thesis. The aim of this study is to understand at which point in the evolutionary chain the enzyme acquired the ability to catalyze the reduction of estrone to estradiol within the pathway of sex hormone synthesis and regulation. To this end, a purification protocol for the orthologous forms of the enzyme Erg27p from microorganisms belonging to the Fungi Kingdom such as Schizosaccharomyces pombe, Botrytis cinerea and Saccharomyces cerevisiae has been developed for subsequent biochemical and enzymatic characterisation studies. After preparing plasmid constructs, the proteins were expressed in Escherichia coli cells and purified, and their estrone reductase and zymosterone reductase activities were tested in vitro.

La famiglia delle 17β-idrossisteroide deidrogenasi (HSD17B) è costituita da 15 isoforme enzimatiche (da HSD17B1 a HSD17B15). Ad oggi solo sette sono state caratterizzate e tuttora non è nota la struttura tridimensionale di HSD17B7, trattandosi essa di una proteina scarsamente solubile e difficilmente purificabile. Quest’ultima può essere considerata un potenziale bersaglio terapeutico di grande interesse per il trattamento di alcune forme tumorali ormono-sensibili in quanto coinvolta nella regolazione del metabolismo di estradiolo e estrone, come i tumori al seno positivi ai recettori per gli estrogeni e i tumori dell’ovaio. HSD17B7 ha due principali attività catalitiche: la 17β-chetosteroide reduttasica responsabile della conversione dell'estrone in 17β-estradiolo, e la 3β-chetosteroide reduttasica deputata alla riduzione del (4-metil)zimosterone in (4-metil)zimosterolo nella biosintesi del colesterolo. Da studi preliminari è emerso che Erg27p di Saccharomyces cerevisiae, enzima ortologo di HSD17B7 umano, non possiede l’attività reduttasica degli ormoni steroidei ma solo l’attività reduttasica degli intermedi della sintesi del colesterolo. Entrambe le attività risultano invece presenti nella HSD17B7 umana e murina, come dimostrato in un lavoro di tesi parallelo. L’obiettivo di questo studio è comprendere in quale punto della catena evolutiva l’enzima abbia acquistato la capacità di catalizzare la riduzione dell’estrone a estradiolo a livello del pathway di sintesi e di regolazione degli ormoni sessuali. A tal fine è stato messo a punto un protocollo di purificazione delle forme ortologhe dell’enzima Erg27p di microrganismi appartenenti al Regno dei Funghi quali Schizosaccharomyces pombe, Botrytis cinerea e Saccharomyces cerevisiae per successivi studi di caratterizzazione biochimica ed enzimatica. Dopo la preparazione dei costrutti plasmidici, le proteine sono state espresse in cellule batteriche di Escherichia coli e purificate per poi testarne in vitro l’attività estrone-reduttasica e zimosterone-reduttasica.