The metabolic syndrome and associated disorders, like obesity and insulin resistance, have an important socioeconomic impact nowadays. This syndrome is associated with an increased risk of developing cardiovascular diseases, such as hypertension and heart attack, and metabolic dysregulation, such as type 2 diabetes mellitus. The underlying chronic inflammatory process, called “Metainflammation”, is also able to damage the integrity of the blood-brain barrier (BBB), the interface between the periphery of our organism and the central nervous system (CNS), and to alter the immune response of microglial and astrocytic cells closely communicating with the barrier endothelial cells (neurovascular unit, NVU). This leads to the possible onset of neurodegenerative disorders. After setting up an in vitro model of neuroinflammation, thanks to a double stimulus with LPS (lipopolysaccharide) and palmitic acid (long-chain saturated fatty acid, used in vitro to mimic a fatty diet condition), the study in question aims to evaluate the possible effect of N-oleoylethanolamide in re-establishing the barrier conditions in response to the induced inflammatory stimulus. N-oleoylethanolamide (OEA), an endogenous product resulting from the degradation of oleic acid at intestinal level, is an endogenous lipid ‘satiety sensor’ capable of controlling food intake and energy homeostasis through the gut-brain signal mediated by PPARα receptors. The proposed model is an in vitro model in which the reactivity of microglia and astrocytic cells and the integrity of the endothelial barrier will be evaluated in response to inflammatory insult and subsequent OEA treatment. Astrocytic cells and microglial cells, both of human origin, are exposed to a double inflammatory stimulus for 24 hours: lipopolysaccharide (LPS 100 ng/ml) and palmitic acid (PA 250 µM), a fatty acid responsible for the activation of innate inflammatory mechanisms through binding to TLR4 receptors. The PA+LPS combination leads, in both treated cell lines, to the activation of typical inflammatory pathways such as NF-κB, pIKb, NLRP3 and the release of inflammatory cytokines (IL-1β, IL-18, IL-6). Then cells are subjected to the inflammatory condition established in co-treatment with OEA (10 µM, 25 µM, 50 µM). Both at astrocytic and microglial level, a slight reduction of the inflammatory response is observed, in particular at the highest concentrations of OEA, as confirmed by the reduced expression of investigated proteins involved in the inflammatory pathway. To study the interaction between cells of the NVU, co-cultures are set up. The cultures are exposed to inflammatory stimuli and to OEA and subsequently the barrier properties are evaluated. In particular, the permeability of endothelial cells co-cultured with astrocytes increases in response to the combination of PA+LPS stimuli in accordance with the simultaneous reduction of membrane expression of one of the proteins present at the level of the tight junctions between endothelial cells, Claudin-5. Subsequent exposure to OEA is effective in preventing this effect on Claudin-5 expression thereby reducing barrier permeability. In conclusion, considering the altered release of OEA induced by a high-fat diet, it would be interesting to investigate the most appropriate therapeutic window to restore endogenous OEA levels offering new treatment opportunities for the prevention of associated neurodegenerative disorders.
La sindrome metabolica e i disordini metabolici, obesità e insulino-resistenza, hanno un impatto socioeconomico importante oggigiorno. A questa sindrome si associa l’aumentato rischio di sviluppare patologie cardiovascolari, come l’ipertensione e l’infarto, e disregolazioni metaboliche, come il diabete mellito di tipo 2. Il processo infiammatorio cronico alla base, metainfiammazione, è capace inoltre di danneggiare l’integrità della barriera emato-encefalica (BEE), interfaccia tra la periferia del nostro organismo e il sistema nervoso centrale (SNC), e alterare la risposta immunitaria delle cellule microgliali e astrocitarie strettamente comunicanti con le cellule endoteliali di barriera (unità neurovascolare). Questo comporta il possibile instaurarsi di disordini neurodegenerativi. Dopo avere settato il modello in vitro di neuroinfiammazione grazie ad un doppio stimolo con LPS (lipopolisaccaride) e acido palmitico (acido grasso saturo a lunga catena, usato in vitro per mimare una condizione di dieta grassa), lo studio in questione si prepone di valutare il possibile effetto dell’N-oleoiletanolamide nel ristabilire le condizioni di barriera e nella risposta allo stimolo infiammatorio indotto. L’N-oleoiletanolamide (OEA), prodotto endogeno derivante dalla degradazione dell’acido oleico a livello intestinale, è un lipide endogeno capace di controllare l’assunzione di cibo e l’omoestasi energetica attraverso il segnale intestino-cervello mediato da recettori PPARα. Il modello proposto è un modello in vitro in cui verrà valutata la reattività della microglia e delle cellule astrocitarie e l’integrità della barriera sottoposte prima a stimolo infiammatorio e successivamente al trattamento con OEA. Il modello in vitro prevede l’esposizione di cellule astrocitarie e cellule microgliali, entrambe di derivazione umana, a doppio stimolo infiammatorio per 24 ore: lipopolisaccaride (LPS 100 ng/ml) e acido palmitico (PA 250 µM), acido grasso responsabile dell’attivazione di innati meccanismi infiammatori attraverso il legame a recettori TLR4. La combinazione PA+LPS comporta, in entrambe le linee cellulari trattate, l’attivazione di tipici pathway infiammatori come NF-κB, pIKb, NLRP3 e il rilascio di citochine infiammatorie (IL-1β, IL-18, IL-6). Le cellule sono sottoposte alla condizione infiammatoria stabilita in co-trattamento con OEA (10 µM, 25 µM, 50 µM). Sia a livello di cellule astrocitarie che microgliali, è stata osservata una lieve riduzione della risposta infiammatoria, significativa a concentrazione più elevate di OEA, confermata dalla riduzione dell’espressione di proteine tipiche dei pathway infiammatori indagati. Per lo studio dell’interazione tra cellule dell’unità neurovascolare e la simulazione di un modello in vitro di BEE sono state settate co-colture. Le colture sono state esposte a stimoli infiammatori e al co-trattamento con OEA e successivamente sono state valutate le proprietà di barriera. In particolare, la permeabilità delle cellule endoteliali in co-coltura con astrociti aumenta in risposta alla combinazione di stimoli PA+LPS in accordo con la contemporanea riduzione dell’espressione in membrana della proteina giunzionale, Claudina-5. La successiva esposizione con OEA si è dimostrata efficace nel prevenire questo effetto sull’espressione di Claudina-5 riducendo di conseguenza la permeabilità di barriera. In conclusione, considerando l’alterato rilascio dell’OEA indotto da una dieta ricca di grassi, sarebbe interessante investigare la più appropriata finestra terapeutica per ripristinare i livelli endogeni di OEA offrendo nuove opportunità di trattamento per la prevenzione di disordini neurodegenerativi associati.
Setting di un modello in vitro di neuroinfiammazione indotta da una dieta ricca di grassi e valutazione del danno di barriera emato-encefalica correlato: possibili benefici dell’ N-Oleoiletanolamide.
VIGLIERMO, STEFANIA
2023/2024
Abstract
La sindrome metabolica e i disordini metabolici, obesità e insulino-resistenza, hanno un impatto socioeconomico importante oggigiorno. A questa sindrome si associa l’aumentato rischio di sviluppare patologie cardiovascolari, come l’ipertensione e l’infarto, e disregolazioni metaboliche, come il diabete mellito di tipo 2. Il processo infiammatorio cronico alla base, metainfiammazione, è capace inoltre di danneggiare l’integrità della barriera emato-encefalica (BEE), interfaccia tra la periferia del nostro organismo e il sistema nervoso centrale (SNC), e alterare la risposta immunitaria delle cellule microgliali e astrocitarie strettamente comunicanti con le cellule endoteliali di barriera (unità neurovascolare). Questo comporta il possibile instaurarsi di disordini neurodegenerativi. Dopo avere settato il modello in vitro di neuroinfiammazione grazie ad un doppio stimolo con LPS (lipopolisaccaride) e acido palmitico (acido grasso saturo a lunga catena, usato in vitro per mimare una condizione di dieta grassa), lo studio in questione si prepone di valutare il possibile effetto dell’N-oleoiletanolamide nel ristabilire le condizioni di barriera e nella risposta allo stimolo infiammatorio indotto. L’N-oleoiletanolamide (OEA), prodotto endogeno derivante dalla degradazione dell’acido oleico a livello intestinale, è un lipide endogeno capace di controllare l’assunzione di cibo e l’omoestasi energetica attraverso il segnale intestino-cervello mediato da recettori PPARα. Il modello proposto è un modello in vitro in cui verrà valutata la reattività della microglia e delle cellule astrocitarie e l’integrità della barriera sottoposte prima a stimolo infiammatorio e successivamente al trattamento con OEA. Il modello in vitro prevede l’esposizione di cellule astrocitarie e cellule microgliali, entrambe di derivazione umana, a doppio stimolo infiammatorio per 24 ore: lipopolisaccaride (LPS 100 ng/ml) e acido palmitico (PA 250 µM), acido grasso responsabile dell’attivazione di innati meccanismi infiammatori attraverso il legame a recettori TLR4. La combinazione PA+LPS comporta, in entrambe le linee cellulari trattate, l’attivazione di tipici pathway infiammatori come NF-κB, pIKb, NLRP3 e il rilascio di citochine infiammatorie (IL-1β, IL-18, IL-6). Le cellule sono sottoposte alla condizione infiammatoria stabilita in co-trattamento con OEA (10 µM, 25 µM, 50 µM). Sia a livello di cellule astrocitarie che microgliali, è stata osservata una lieve riduzione della risposta infiammatoria, significativa a concentrazione più elevate di OEA, confermata dalla riduzione dell’espressione di proteine tipiche dei pathway infiammatori indagati. Per lo studio dell’interazione tra cellule dell’unità neurovascolare e la simulazione di un modello in vitro di BEE sono state settate co-colture. Le colture sono state esposte a stimoli infiammatori e al co-trattamento con OEA e successivamente sono state valutate le proprietà di barriera. In particolare, la permeabilità delle cellule endoteliali in co-coltura con astrociti aumenta in risposta alla combinazione di stimoli PA+LPS in accordo con la contemporanea riduzione dell’espressione in membrana della proteina giunzionale, Claudina-5. La successiva esposizione con OEA si è dimostrata efficace nel prevenire questo effetto sull’espressione di Claudina-5 riducendo di conseguenza la permeabilità di barriera. In conclusione, considerando l’alterato rilascio dell’OEA indotto da una dieta ricca di grassi, sarebbe interessante investigare la più appropriata finestra terapeutica per ripristinare i livelli endogeni di OEA offrendo nuove opportunità di trattamento per la prevenzione di disordini neurodegenerativi associati.| File | Dimensione | Formato | |
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