Produzione delle proteine MEK ed ERK e studio della loro interazione mediante tecnica dello Stopped-Flow

La ricerca biologica negli ultimi anni è stata focalizzata sulla comprensione dei meccanismi che regolano le basi della funzione cellulare a livello molecolare, ora sappiamo che le risposte delle cellule a stimoli esterni sono determinate da complesse reti di segnalazione intracellulari, composte essenzialmente da vie biochimiche basate sulle interazioni binarie protena-proteina. La conoscenza dei meccanismi cellulari e una migliore caratterizzazione delle interazioni molecolari potrebbero contribuire allo sviluppo di efficaci strategie terapeutiche. Nel lavoro presentato in questa tesi è stata studiata l'interazione di MEK con ERK, due proteine appartenenti alla via di trasduzione del segnale intracellulare delle proteine chinasi attivate da mitogeno (Mitogen Activated Protein Kinase, MAPK) attraverso la tecnica dello Stopped-Flow. La famiglia delle MAPK comprende serina-treonina chinasi espresse in tutte le cellule eucariote, nelle quali svolgono un ruolo fondamentale in numerosi processi tra cui la proliferazione, il differenziamento e l'apoptosi1. Questa scelta è stata motivata dal fatto che nonostante la via di segnale delle MAPK sia uno dei più importanti sistemi di trasmissione dell'informazione intracellulare, pochi risultano essere gli studi quantitativi sulla cinetica dei suoi componenti. In una prima fase di lavoro sono state prodotte le proteine ricombinanti di interesse, MEK e ERK, nella fase successiva queste sono state bioconiugate con un idoneo fluoroforo ed infine sono stati misurati i parametri cinetici dell'interazione mediante la tecnica dello Stopped-Flow2. Per la prima volta sono stati misurati sperimentalmente i valori corrispondenti alla kon (costante velocità di associazione) e koff (costante velocità di dissociazione) di tale interazione e successivamente è stato calcolato il valore di Kd (costante di dissociazione) attraverso il rapporto koff/kon. La Kd ottenuta è risultata in perfetto accordo con i dati riportati precedentemente in studi effettuati in vitro3,4. Questo ci permette di proporre l'utilizzo dello Stopped-Flow, secondo l'approccio seguito in questo lavoro, come metodo valido e relativamente veloce per misurare sperimentalmente in vitro i parametri cinetici relativi all'interazione binaria proteina-proteina.