Analisi degli effetti dei peptidi derivati dal gene della grelina sul browning e sulla termogenesi del tessuto adiposo

White adipose tissue (WAT) is the main energy reservoir of the body, whereas brown adipose tissue (BAT) acts as a defense against cold and regulator of metabolic functions by dissipating energy as heat via uncoupling protein 1 (UCP1), hallmark of thermogenesis in brown/beige adipocytes. The “browning” is the phenomenon that occurs when adipocytes differentiate from white to brown, leading to increased thermogenesis. Obesity is characterized by excessive energy intake and reduced energy expenditure in adipose tissue (AT). Hence, the development of effective anti-obesity molecules promoting browning and enhancing energy expenditure has gained attention in recent years. The ghrelin gene-derived peptides, acylated ghrelin (GHRL), des-acyl ghrelin (D-AG) and obestatin (OBE), are key regulators of energy homeostasis. In vivo studies suggested that GHRL promotes adipogenesis and exerts inhibitory effects on UCP1 mRNA expression in BAT. Conversely, D-AG and OBE, mediate positive metabolic effects. However, so far, the potential role of ghrelin-derived peptides on WAT browning and BAT functions remains unclear. Thus, here we studied the effects of GHRL, D-AG, OBE on browning and thermogenesis in both murine 3T3-L1 adipocytes and primary human samples obtained from obese individuals. The following differentiation protocols were used: 3T3-L1 preadipocytes were differentiated into white adipocytes for 10 days and then transdifferentiated into beige cells for 72 h in the absence or presence of GHRL, D-AG or OBE (500 nM); fresh small fragments of human subcutaneous and visceral adipose tissues (hSAT and hVAT) were directly exposed to a 24 h treatment with GHRL, D-AG or OBE (500 nM); mature adipocytes isolated from hSAT (MA ScAds) were stimulated for 24 h with or without each peptide (500 nM); preadipocytes-derived from hSAT were differentiated into mature white adipocytes for 21 days and then transdifferentiated into beige cells for 72 h, in the absence or presence of GHRL, D-AG or OBE (500 nM). Specifically, in transdifferentiated 3T3-L1, real-time PCR analysis revealed that, D-AG and OBE, but not GHRL, increased the mRNA levels of BAT/BeAT markers (Ucp-1, Pgc-1α, Prdm16, Tmem26, CD137 and Dio2), as well as batokines (IGF-I, IL6, AdipoQ, NGF, GDF15 and FGF21). Additionally, D-AG and OBE, but not GHRL, affected the regulation of both lipid and glucose metabolism. In particular, D-AG and OBE, enhanced isoproterenol-induced lipolysis as well as protein levels of lipolytic enzymes HSL and ATGL and mRNA expression of lipolytic marker Cpt-1a, while reducing lipogenic effector C/ebp. Moreover, D-AG and OBE increased glucose uptake and Sirt1 mRNA levels and altered GLUT4 intracellular distribution in beige adipocytes. Morphologically, these cells showed characteristics of brown-like adipocytes, including an increased number of small lipid droplets and round-shaped mitochondria, as assessed by Oil Red O staining and electron microscopy, respectively. Importantly, mitochondrial biogenesis, content and activity was enhanced by treatment with D-AG- and OBE, but not GHRL. Accordingly, the browning and thermogenic effects of D-AG and OBE involved activation of cAMP/PKA/CREB and AMPK/SIRT1 pathways. Finally, D-AG and OBE, but not GHRL, upregulated the mRNA levels of brown genes UCP-1, PGC-1α, PRDM16 in hSAT and hVAT, MA ScAds, and ScPre-Ads, along with an improvement in the mitochondrial activity in ScPre-Ads. Collectively, these finding suggest that unlike GHRL showing no effect, D-AG and OBE promote browning and increase thermogenesis, suggesting their use as a potential therapeutic option for treatment of obesity and metabolic diseases.

Il tessuto adiposo bianco (WAT) è la principale riserva energetica del corpo, mentre il tessuto adiposo bruno (BAT) svolge un ruolo nella difesa contro il freddo e nella regolazione metabolica, dissipando energia sotto forma di calore grazie all’azione della proteina disaccoppiante 1 (UCP1), marcatore chiave della termogenesi negli adipociti bruni/beige. Il fenomeno del “browning” si verifica quando gli adipociti bianchi si differenziano in adipociti beige, aumentando la termogenesi. L’obesità è caratterizzata da un eccessivo apporto energetico e da una ridotta spesa energetica nel tessuto adiposo (AT). Pertanto, lo sviluppo di molecole anti-obesità che promuovano il browning e aumentino la spesa energetica ha attirato crescente interesse negli ultimi anni. I peptidi derivati dal gene della grelina, ghrelina acilata (GHRL), des-acil ghrelina (D-AG) e obestatina (OBE), hanno un ruolo chiave nel regolare l’omeostasi energetica. Studi in vivo hanno mostrato che GHRL promuove l’adipogenesi e inibisce l’espressione di UCP1 nel BAT, mentre D-AG e OBE hanno effetti metabolici positivi. Tuttavia, il loro ruolo nel browning del WAT e nella funzione del BAT non è ancora del tutto chiaro. Per questo motivo, abbiamo quindi studiato gli effetti di GHRL, D-AG e OBE sulla termogenesi e sul browning in adipociti murini 3T3-L1 e in campioni umani prelevati da individui obesi. Sono stati usati i seguenti protocolli di differenziazione: i preadipociti 3T3-L1 sono stati differenziati in adipociti bianchi per 10 giorni e poi transdifferenziati in adipociti beige per 72 ore, con o senza GHRL, D-AG o OBE (500 nM); i frammenti di tessuto adiposo sottocutaneo e viscerale umano (hSAT e hVAT) sono stati trattati direttamente per 24 ore con questi peptidi; sono stati stimolati per 24 ore con o senza peptidi (500 nM) gli adipociti maturi isolati da hSAT (MA ScAds) e i preadipociti derivati da hSAT, differenziati in adipociti bianchi maturi per 21 giorni e poi transdifferenziati in beige per 72 ore con o senza peptidi (500 nM). L’analisi tramite PCR in cellule 3T3-L1 ha mostrato che D-AG e OBE, ma non GHRL, aumentano i livelli di mRNA di marcatori BAT/BeAT (Ucp-1, Pgc-1α, Prdm16, Tmem26, CD137, Dio2) e batochine (IGF-I, IL6, AdipoQ, NGF, GDF15, FGF21). Inoltre, D-AG e OBE hanno influenzato il metabolismo lipidico e glucidico potenziando la lipolisi indotta da isoproterenolo, aumentando l’espressione proteica degli enzimi lipolitici HSL e ATGL, incrementando i livelli di mRNA del marcatore Cpt-1a e riducendo invece l’espressione dell’effettore lipogenico C/ebp. Inoltre, D-AG e OBE hanno aumentato il metabolismo glucidico, i livelli di Sirt1 e alterato la distribuzione intracellulare del trasportatore GLUT4 negli adipociti beige. Morfologicamente queste cellule hanno mostrato caratteristiche tipiche degli adipociti bruni, con un numero maggiore di piccole gocce lipidiche e mitocondri di forma rotondeggiante, come riportato rispettivamente dalle analisi Oil Red O e di microscopia elettronica. Il browning e l’effetto termogenico coinvolgono l’attivazione delle vie di segnale cAMP/PKA/CREB e AMPK/SIRT1. Infine, D-AG e OBE, ma non GHRL, hanno aumentato l’espressione dei geni tipici degli adipociti bruni (UCP-1, PGC-1α, PRDM16) nei campioni di hSAT, hVAT, MA ScAds, e ScPre-Ads, e migliorato l’attività mitocondriale di questi ultimi. Nel complesso, questi dati suggeriscono che, a parte GHRL che non ha mostrato effetti, D-AG e OBE promuovono il browning e la termogenesi, rappresentando una potenziale strategia terapeutica per il trattamento dell’obesità e delle malattie metaboliche.