Analisi del profilo di metilazione del dna libero circolante per il monitoraggio della GVHD nel trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche

The present study aims to evaluate the use of circulating free DNA (cfDNA) and its methylation profile as non-invasive biomarkers for monitoring patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT), in order to detect, at an early stage, the onset of the complications most frequently associated with this procedure, with particular attention to acute graft versus host disease (aGVHD). After recruiting a cohort consisting of both patients and healthy subjects to serve as controls, plasma samples were collected and analyzed through fluorimetric quantification of cfDNA. In the case of patients, these samples were taken at seven follow-up stages, both before and after transplantation, in order to correlate the changes in the biomolecule’s levels with the onset of clinical complications. The results show a significant increase in cfDNA associated with both infections and, above all, aGVHD. The cfDNA extracted from patients’ plasma, both under stable conditions and in the presence of aGVHD, was then used to synthesize libraries enriched for the most indicative nucleotide sequences—that is, those characterized by a peculiar epigenetic profile of the cell types most involved in the pathogenesis of aGVHD, primarily consisting of immune, gastrointestinal, hepatic, and skin cells. These libraries were subjected to enzymatic conversion and next-generation sequencing (NGS), and the sequencing results were employed in subsequent bioinformatic analyses aimed at identifying differentially methylated regions (DMRs) between aGVHD cases and controls. The results revealed significant differences in the methylation profile of cfDNA both between cases and controls and in relation to the organ affected by aGVHD, suggesting a marked tissue specificity in the release of cfDNA as a consequence of the pathology under analysis. These findings support the hypothesis that the methylation profile of cfDNA may represent a reliable indicator of tissue damage and immune activation, offering a useful diagnostic tool for the monitoring and personalized management of patients.

Il presente studio ha l’obiettivo di valutare il possibile impiego del DNA libero circolante (cfDNA) e del suo profilo di metilazione come biomarcatori non invasivi per il monitoraggio di pazienti sottoposti a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche (allo-TCSE), in modo tale da rilevare, precocemente, l’insorgenza delle complicanze più frequentemente associate a tale intervento, con particolare attenzione per la Graft versus host disease nella sua variante acuta (aGVHD). Dopo aver arruolato una coorte composta sia da pazienti sia da soggetti sani, da impiegare come controllo, sono stati prelevati ed analizzati, mediante quantificazione fluorimetrica del cfDNA, alcuni loro campioni di plasma, prelevati, nel caso dei pazienti, in corrispondenza di 7 fasi di follow‐up sia antecedenti sia posteriori al trapianto, al fine di correlare l’andamento dei livelli della biomolecola con l’insorgenza delle complicanze cliniche; i risultati provano un aumento significativo del cfDNA in corrispondenza sia delle infezioni sia, soprattutto, di aGVHD. Il cfDNA estratto dal plasma dei pazienti, sia in condizioni di stabilità sia in presenza di aGVHD, è stato poi impiegato per la sintesi di librerie arricchite in corrispondenza delle sequenze nucleotidiche maggiormente indicative, ovvero quelle caratterizzate da un profilo epigenetico peculiare dei tipi cellulari maggiormente coinvolti nella patogenesi della aGVHD, costituiti, principalmente, da cellule immunitarie, gastrointestinali, epatiche e cutanee. Le librerie così create sono state sottoposte a conversione enzimatica e sequenziamento mediante tecnologie di nuova generazione (NGS) ed i risultati del sequenziamento sono stati impiegati nelle successive analisi bioinformatiche, volte ad identificare regioni differenzialmente metilate (DMRs) tra i casi di aGVHD ed i controlli. I risultati hanno evidenziato l’esistenza di differenze significative nel profilo di metilazione del cfDNA sia tra casi e controlli sia in relazione all’organo colpito dalla aGVHD, suggerendo una marcata specificità tissutale nel rilascio del cfDNA conseguente alla patologia in analisi. Queste evidenze supportano l’ipotesi che il profilo di metilazione del cfDNA possa rappresentare un indicatore affidabile di danno tissutale e attivazione immunitaria, offrendo uno strumento diagnostico utile per il monitoraggio e la gestione personalizzata dei pazienti.