Validazione di nuovi substrati per saggi di immunofluorescenza indiretta: il modello della malattia celiaca

Le malattie autoimmuni costituiscono un insieme di patologie caratterizzate da un'alterazione del sistema immunitario che comporta lo sviluppo di risposte cellulari e umorali dirette contro componenti dell'organismo dovute a rottura della tolleranza immunologica. La malattia celiaca (MC) è una patologia autoimmune caratterizzata da un malassorbimento intestinale e da una caratteristica lesione intestinale. La MC si instaura in individui geneticamente suscettibili che ingeriscono prodotti alimentari contenenti glutine: tra questi il grano, la segale, l'orzo. La gliadina è una miscela di proteine costituenti il glutine, ed è la diretta responsabile del danno intestinale. Gli anticorpi anti- endomisio (EMA) sono fondamentali per la diagnosi di MC. Questi legano l'endomisio della muscolatura liscia, dando un segnale in immunofluorescenza sensibile (95%) e specifico (100%). Inoltre, la rilevazione di questi autoanticorpi può essere suffragata dal dosaggio immunochimico degli anticorpi anti-transglutaminasi tissutale (anti-tTG), responsabile della deaminazione dei residui di glutamina e della loro conversione in acido glutammico, i quali riconoscono lo stesso antigene degli EMA. Le analisi effettuate richiedono tecniche di immunofluorescenza indiretta (IFA) in cui gli anticorpi da dosare vengono incubati in vetrini con sezioni istologiche di scimmia. Tuttavia questi metodi presentano svantaggi sia dal punto di vista etico che economico come l'allevamento, la nutrizione, i controlli e la stabulazione delle cavie. Per ovviare a ciò, si è pensato di utilizzare cellule di medulloblastoma (MDB), esprimenti discreti valori di tTG, come substrati diagnostici. Così facendo, sarebbe possibile condurre analisi di IFA per gli EMA e gli anticorpi anti-tTG, senza utilizzare tessuti provenienti da cavie animali. Le cellule di MDB sono state deposte sia su vetrini con metodica manuale, sia su vetrini serigrafati a 12 pozzetti, già presenti in commercio, e opportunamente modificati. Gli esperimenti, hanno mostrato che, sui vetrini serigrafati, le cellule di MDB, incubate con sieri negativi per gli EMA e per gli anticorpi anti- tTG, non mostrano fluorescenza, mentre le cellule incubate con sieri positivi mostrano fluorescenza. Poiché le cellule di MDB esprimono la tTG non a valori eccezionalmente elevati, si è trattato per 24 ore alcune cellule con doxorubicina o quercetina, entrambe molecole in grado di aumentare l'espressione di tTG. Le cellule trattate con quercetina, e incubate con il siero positivo per EMA e per gli anticorpi anti-tTG, hanno evidenziato una fluorescenza più spiccata rispetto alle cellule non trattate; tale incremento però non è stato riscontrato nelle cellule trattate con doxorubicina, forse a causa della sua natura apoptotica. I risultati ottenuti sulle cellule di MDB sono stati perfettamente concordi con quelli acquisiti su sezioni istologiche, suggerendo che, con il proseguimento di questo studio, si potrebbe sviluppare un nuovo metodo diagnostico per la rilevazione degli EMA e degli anticorpi anti-tTG, necessario alla diagnosi della malattia celiaca, basato sull'innovativo utilizzo di cellule di medulloblastoma, piuttosto che sezioni di esofago di scimmia.