Le squaraine come innovativi agenti fotosensibilizzanti per la terapia fotodinamica: valutazione e analisi in vitro della loro attività antitumorale

Photodynamic therapy (PDT) is an antitumor not invasive treatment based on the light-induced activation of a photosensitizer generating highly reactive oxygen species (ROS), in the presence of molecular oxygen, that induce malignant tissue destruction. In this study, we have investigated several halogenated or not squaraine compounds in position 5, with the aim to evaluate their efficacy as photosensitizers in PDT. Compared to other photosensitizers, squaraine dyes show a sharp and intense absorption bands in the infrared region, thanks to introduction of heavy atoms, inducing an increase light penetration inside tissues and ROS production. The in vitro photodynamic effect of squaraine dyes was performed on a human tumor fibrosarcoma cell line (HT-1080). Specifically the squaraine dyes SQ-Br-C4 and SQ-I-C4 (1 µM), showed a greater cytotoxic effect after PDT. Therefore, the photodynamic effect of these two compounds was analysed on cell death, ROS production, DNA damage, release of cytosolic cytochrome c and on the expression of some genes involved in apoptotic and stress oxidative pathway. After evaluating the localization of SQ-Br-C4 and SQ-I-C4 in HT-1080 mitochondria, we observed an increase in necrotic events 6 hours after PDT, with a massive ROS production in the first 15 minutes after LED irradiation (15 mW/cm2 for 20 minutes). Necrosis cell death was moreover supported by the analysis of DNA damage and the release of cytochrome c after the treatment. Indeed both SQ-Br-C4 and SQ-I-C4 induced a damaged on DNA, while the release of cytosolic cytochrome c decreased over time. Furthermore, the gene expression analysis of some apoptotic and stress oxidative genes seems to support the hypothesis that SQ-Br-C4 and SQ-I-C4 induce a high oxidative stress bringing to cell death. Indeed this hypothesis has already been supported by an up-regulation of GPX1, involved in the oxidative stress pathway and a down-regulation of the apoptotic gene (BCL-2), even though SQ-Br-C4 and SQ-I-C4 compounds seem to induce some effects alone. In conclusion, the achieved results demonstrate that squaraine dyes SQ-Br-C4 and SQ-I-C4 show a good in vitro antitumor activity and they might be considered as potential and promising photosensitizers for future in vitro and in vivo studies.

La terapia fotodinamica (PDT) è un trattamento antitumorale non invasivo basato sull'attivazione mediante la luce di un agente fotosensibilizzante che, grazie alla presenza di ossigeno, è in grado di generare specie reattive dell'ossigeno (ROS) che possono determinare la morte nella cellula tumorale. In questo elaborato sono stati testati diversi composti squarainici (SQ), alogenati e non-alogenati in posizione 5, con lo scopo di valutarne l'efficacia antitumorale come innovativi agenti fotosensibilizzanti per la terapia fotodinamica. Essi sono caratterizzati dal rispondere, rispetto ai comuni fotosensibilizzanti, a lunghezze d'onda maggiori con, una migliore capacità di penetrazione nei tessuti e una maggiore produzione di ROS dovuta alla presenza dei sostituenti inseriti nella struttura. L'effetto fotodinamico sulla proliferazione cellulare dei diversi composti squarainici è stato valutato, in vitro, in una linea cellulare di fibrosarcoma umano, HT-1080. E' stato possibile evidenziare come le squaraine SQ-Br-C4 e SQ-I-C4 (1 µM), rispettivamente bromo e iodio sostituite e con due catene a 4 atomi di carbonio sull'azoto di ogni indolenina, abbiano un maggior effetto citotossico di tipo fotodinamico rispetto agli altri composti analizzati. Sono stati quindi studiati nello specifico gli effetti biologici indotti dal trattamento fotodinamico con le squaraine SQ-Br-C4 e SQ-I-C4, valutando il tipo di morte cellulare, la generazione di ROS, il danno al DNA, rilascio del citocromo c nel citoplasma e le variazioni dell'espressione genica in alcuni geni coinvolti nel pathway apoptotico e nello stress ossidativo. I risultati ottenuti dimostrano che le squaraine alogenate, SQ-Br-C4 e SQ-I-C4, che si localizzano principalmente nei mitocondri, determinano la morte per necrosi delle cellule di fibrosarcoma a 6 ore dal trattamento fotodinamico, con una produzione massiva di ROS nei primi 15 minuti in seguito all'illuminazione con il LED (15 mW/cm2 per venti minuti). L'induzione della morte per necrosi è sostenuta anche dai risultati ottenuti dall'analisi del danno al DNA e dal rilascio del citocromo c in seguito al trattamento fotodinamico. Infatti si osserva come le squaraine alogenate siano in grado di danneggiare il DNA in seguito al trattamento fotodinamico e inducano, nel tempo, un decremento del rilascio del citocromo c nel citoplasma. Le analisi dell'espressione genica di alcuni geni coinvolti nel pathway apoptotico o dello stress ossidativo sembrano supportare l'ipotesi che le squaraine SQ-Br-C4 e SQ-I-C4 determinino un elevato grado di stress ossidativo responsabile della necrosi delle cellule di fibrosarcoma HT-1080. Infatti questa ipotesi sembra essere già sostenuta dai primi risultati ottenuti, i quali riportano una iper-espressione di GPX1, gene coinvolto nel pathway dello stress ossidativo, e una down-regolazione del gene apoptotico BCL-2. In conclusione i risultati fin qui conseguiti sembrano dimostrare che le squaraine alogenate SQ-Br-C4 e SQ-I-C4 siano composti in grado di determinare una significativa attività antitumorale in vitro e, quindi, promettenti agenti fotosensibilizzanti per ulteriori studi in vitro e in vivo.