Regolazione del Ca2+ intracellulare nel muscolo liscio delle vie aeree. Possibili implicazioni nella terapia dell'asma.

L'asma rappresenta un grande problema di salute a livello mondiale, è infatti una delle patologie croniche più diffuse ed è in crescente aumento. Il muscolo liscio delle vie aeree, considerato da alcuni autori ¿un organo vestigiale¿, oltre a non avere una funzione fisiologica ben definita, è coinvolto nella patogenesi dell'asma. La costrizione delle vie aeree è infatti una delle caratteristiche principali della patologia. Nel muscolo liscio il rilassamento è possibile grazie all'attivazione, mediata dalle catecolamine, di recettori β2-adrenergici (β2-ARs) che promuovono la produzione di adenosina monofosfato ciclico (cAMP), responsabile della diminuzione della concentrazione intracellulare di ioni calcio (Ca2+). Poiché la contrazione del muscolo liscio, come quella del muscolo striato, è calcio (Ca2+) dipendente, è evidente l'importanza di cAMP nel regolare questo processo. Per questo motivo e considerando che la terapia attuale dell'asma, che prevede principalmente l'impiego di glucocorticoidi e agonisti β2-adrenergici, in alcuni casi mostra efficacia limitata, è auspicabile l'identificazione di nuovi farmaci volti a mantenere l'omeostasi di cAMP nel muscolo liscio delle vie aeree. Recentemente è stato scoperto che la funzione scaffold della fosfoinositide 3-chinasi  (PI3K) è presente anche nel muscolo liscio delle vie aeree. Il legame tra fosfoinositide 3-chinasi  (PI3K) e protein chinasi A (PKA) promuove l'attività della fosfodiesterasi (PDE), favorendo la degradazione di cAMP e lo spegnimento della via di segnale a valle dei recettori β2-ARs con conseguente riduzione del rilassamento muscolare. Il peptide Trojan-PI3K (brevetto TO2014A001105) dovrebbe costituire un inibitore di PI3K e potrebbe quindi indurre effetti bronco-rilassanti simili a quelli mediati dagli agonisti β2-adrenergici senza causare, come questi, l'inattivazione del recettore. Nello studio condotto in questa tesi si è voluto approfondire il ruolo svolto dalle variazioni di concentrazione intracellulare dello ione Ca2+ nei meccanismi di trasduzione di segnali pro-contrattili e pro-rilassanti in cellule umane di muscolo liscio delle vie aeree. Inoltre si è voluta valutare la capacità del peptide Trojan-PI3K di influenzare (tramite cAMP) l'omeostasi del Ca2+ e, di conseguenza, la contrattilità nei miociti bronchiali umani. I miociti sono stati caricati con la sonda fluorescente Indo-1 AM e, in base al pretrattamento cui sono stati sottoposti, sono stati distinti tre gruppi sperimentali: miociti non pretrattati, miociti pretrattati con peptide Trojan-PI3K e miociti pretrattati con peptide di controllo P1. Per tutti e tre i gruppi sperimentali sono state monitorate, al microscopio a fluorescenza, le variazioni nella concentrazione di Ca2+ in risposta a un protocollo che prevedeva la stimolazione in successione con Tyrode KCl (soluzione depolarizzante), carbacolo, salbutamolo e salbutamolo+carbacolo. Le fluttuazioni del calcio sono state valutate come rapporto di fluorescenza a 400 nm (spettro di emissione di Indo-1 AM legato al Ca2+ ) su 490 nm (spettro di emissione di Indo-1 AM non legato al Ca2+), emessa dalle cellule eccitate a 350 nm. I miociti pretrattati con peptide Trojan-PI3K e stimolati con le soluzioni carbacolo e Tyrode KCl hanno mostrato una riduzione significativa della concentrazione intracellulare di Ca2+ rispetto ai miociti non pretrattati e rispetto ai miociti pretrattati con peptide di controllo P1. Pertanto il peptide Trojan-PI3K è in grado di indurre effetti rilassanti nelle cellule muscolari lisce delle vie aeree.