Studio del ruolo delle reti perineuronali nella plasticità cerebrale adulta nei roditori

The experiences we live every day influence our behaviour and our health, determining who we are. Our brain is continuously exposed to environmental factors and neurons respond to these inputs by modifying their synapses and activity through a process called neuronal plasticity. The brain is highly sensitive to experience especially during the critical periods in early development but, however, plasticity is also evident and determinant in the adult brain. NMDA receptor and perineuronal nets (PNNs) are two important players in synaptic plasticity. The first is an ionotropic glutamate receptor and mediates excitatory synaptic transmission in the mammalian brain. It is formed by three different subunits (GluN1-3), but the essential one is the GluN1 (NR1), which is encoded by the Grin1 gene. NMDAR is fundamental in memory processes and NR1 subunit conditional deletion can lead to deficiencies in long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) forms of plasticity. PNNs, on the other hand, are extracellular matrix (ECM) structures formed by members of the lectican family of chondroitin sulfate proteoglycans and surround the soma, proximal dendrites and axon initial segment of neurons to stabilize their connections. Neurons preferentially enveloped by PNNs are the inhibitory parvalbumin (PV)-positive GABAergic interneurons, that are involved in shaping critical periods of plasticity. The main aim of the present study is to evaluate PNN expression following genetic and environmental manipulation in adult rodents. In the first experiment, to study the role of NMDAR-dependent activity in fear memory and in the expression of plasticity brakes in adulthood, the Grin1 gene was deleted by stereotaxic injection of a cocktail of recombinant adeno-associated viruses (rAAVs) in the lateral/basolateral amygdala (LA/BLA) and in the medial prefrontal cortex (mPFC) of Grin12lox mice, to generate Grin1ΔLA/BLA-mPFC double KO mice. The deletion specifically in the LA/BLA and mPFC of Grin1ΔLA/BLA-mPFC mice was validated by immunohistochemistry for NR1. Interestingly, the staining of PNNs in the same mouse brains revealed a significant decrease in PNN density in the knocked out areas, whereas NeuN and Nissl staining confirmed neuronal integrity. In the second experiment, c-fos expression analysis was performed in brain slices of eight groups of C57BL/6 wild-type mice, to assess how multiple areas of the brain are activated by different fear conditioning treatments and learning and memory phases. Immunofluorescence and quantification of c-fos+ cells were evaluated in the medial prefrontal cortex (prelimbic and infralimbic regions), amygdala (LA and BLA), auditory cortex, paraventricular area of the thalamus (PV) and hippocampus (CA1, CA3 and DG). In the third and last experiment we analysed PNN expression in an environmentally induced rat model of autism spectrum disorder, to verify if PNN alterations in specific brain areas may be associated to the pathophysiology of the disease. Moreover, we also assessed if progesterone treatment given to the mothers could ameliorate possible plasticity alterations in the adult brain of the male offspring with the autistic-like phenotype. All these experimental procedures confirmed that NMDA receptors and PNNs modulate adult brain plasticity in rodents and may therefore represent important targets for potential therapeutic interventions.  

Il nostro cervello è continuamente esposto a fattori ambientali e i neuroni rispondono a questi stimoli attraverso la plasticità neuronale. Il cervello è sensibile all'esperienza specialmente durante i periodi critici nel precoce sviluppo ma, tuttavia, la plasticità appare determinante anche nel cervello adulto. Il recettore NMDA e le reti perineuronali (PNNs) sono fondamentali nella plasticità sinaptica. Il primo è un recettore ionotropico per il glutammato e media la trasmissione sinaptica eccitatoria nel cervello dei mammiferi. È formato da tre differenti subunità (GluN1-3), ma quella essenziale è GluN1(NR1), codificata dal gene Grin1. NMDAR è importante nei processi di memoria e la delezione condizionale della subunità NR1 può portare a carenze nella plasticità di potenziamento a lungo termine (LTP) e depressione a lungo termine (LTD). Le PNNs, invece, sono strutture di matrice extracellulare formate da membri della famiglia dei lecticani dei proteoglicani condroitin solfato e circondano il soma, i dendriti prossimali e il segmento iniziale dell'assone nei neuroni per stabilizzare le loro connessioni. I neuroni preferenzialmente circondati dalle PNNs sono gli interneuroni GABAergici inibitori positivi alla parvalbumina (PV), coinvolti nella formazione dei periodi critici di plasticità. Lo scopo principale dello studio è quello di valutare l'espressione delle PNNs a seguito della manipolazione genetica e ambientale nei roditori adulti. Nel primo esperimento, per studiare il ruolo dell'attività NMDAR-dipendente nella memoria della paura e nell'espressione dei freni di plasticità nell'età adulta, il gene Grin1 è stato cancellato tramite iniezione stereotassica di un insieme di virus ricombinanti adeno-associati nell'amigdala baso/laterale (LA/BLA) e nella corteccia mediale prefrontale (mPFC) di topi Grin12lox, per generare Grin1ΔLA/BLA-mPFC topi con doppio knock-out (KO). La delezione specifica nella LA/BLA e nella mPFC di topi Grin1ΔLA/BLA-mPFC è stata validata con l'immunoistochimica per NR1. Inoltre, la colorazione per le PNNs negli stessi cervelli di topo ha rivelato un decremento nella densità delle PNNs nelle aree di KO, mentre le colorazioni NeuN e Nissl hanno confermato l'integrità neuronale. Nel secondo esperimento, l'analisi dell'espressione di c-fos è stata effettuata su fette di cervello di 8 gruppi di topi C57BL/6 wild-type, per valutare come più aree del cervello siano attivate da trattamenti differenti di condizionamento alla paura e dalle fasi di apprendimento e memoria. L'immunofluorescenza e la quantificazione di cellule c-fos+ sono state valutate nella corteccia mediale prefrontale (regioni prelimbica e infralimbica), amigdala (LA e BLA), corteccia uditiva, area paraventricolare del talamo (PV) e ippocampo (CA1, CA3 e DG). Nell'ultimo esperimento abbiamo analizzato l'espressione delle PNNs in un modello di ratto indotto a disturbo dello spettro autistico con particolari condizioni ambientali, per verificare se le alterazioni delle PNNs in specifiche aree del cervello possano essere associate alla patofisiologia del disordine. Inoltre, abbiamo valutato se il trattamento di progesterone dato alle madri potesse migliorare le alterazioni di plasticità nel cervello adulto della prole maschile con fenotipo autistico. Tutte queste procedure sperimentali hanno confermato che il recettore NMDA e le PNNs modulano la plasticità del cervello adulto nei roditori e possono essere importanti per eventuali interventi terapeutici.