Studio delle potenzialità patogene di Arcobacter butzleri durante l'infezione simulata di modelli intestinali umani

Arcobacter butzleri (Campylobacteraceae family) is a gram-negative foodborne pathogen, frequently isolated from animals such as pig, human, chicken and ruminants and from sea and superficial water, soil, mollusks and seafood. This infection causes gastrointestinal disorders, with diarrhea and in some cases, it could get worse in septicemia. This thesis aims to investigate the behavior of the foodborne pathogen Arcobacter butzleri during host-pathogen interaction condition by the use of in vitro intestinal cell models. At the beginning of this study, intestinal adenocarcinoma cell cultures (Caco-2 and HT-29 non mucus-producer and HT-29 MTX, mucus-producer) were cultured in order to simulate human intestinal conditions. Cells have been used in 2D and 3D in vitro models, on which the ability of colonize and invade human cells by A. butzleri LMG 10828T has been investigated. Simultaneously, the expression of putative virulence genes (cadF, mviN, irgA, tlyA, cj1349, pldA, hecA, hecB e ciaB) has been investigated by RT-qPCR analysis. These genes are generally used to detect pathogenic species inside the genus Arcobacter. 2D in vitro models have been also applied on 32 A. butzleri strains isolated from feces of human, dog, horse, sheep, chicken, cow and pig and from pork meat, in order to investigate differences in adhesion and colonization ability between strains and depending on source. Later, bioinformatics analysis have been performed: after DNA extraction and sequencing, reads have been assembled and functionally annotated by using software Prokka; moreover, phylogenetic analysis and SNP mining have been carried out compared with reference genome (A.butzleri RM4018, or LMG 10828T). Results showed a similar colonization and invasion ability among the strains; moreover, mucus from HT-29 MTX cells contribute to the invasion by the pathogen. Colonization and invasion analysis confirmed pathogenic ability of A. butzleri strains; furthermore, the same behavior within the species has been noticed and the bioinformatic approach led a partial phylogenetic grouping based on isolation matrices. These results provide useful information for future works on transcriptome by omics techniques (e.g. RNA-seq) in order to better understand the virulence mechanisms of A. butzleri.

Arcobacter butzleri (famiglia Campylobacteriaceae) è un batterio patogeno alimentare emergente, gram negativo, frequentemente isolato da carni bovine, suine e avicole oltre che da acque marine ed acque superficiali, terreni, campioni fecali, frutti di mare, molluschi. I disturbi causati da questo patogeno in uomo risultano essere principalmente gastrointestinali, accompagnati da diarrea e in alcuni casi le complicazioni dall'infezione possono sfociare in setticemia. L'obiettivo di questo lavoro di tesi è stato quello di studiare il potenziale patogeno di questo microrganismo, in condizioni di interazione ospite-patogeno attraverso l'utilizzo di modelli cellulari intestinali umani in vitro. La prima fase di questo studio si è concentrata sulla coltura di tre linee cellulari di adenocarcinoma del colon ed in particolare leCaco-2, HT-29 e HT-29 MTX (quest'ultima produttrice di muco), utilizzate per la simulazione in vitro, su modelli in purezza e misti, delle condizioni dell'intestino umano. Le cellule sono state utilizzate per l'allestimento di modelli 2D e 3D al fine di studiare il comportamento di A. butzleri LMG 10828T (RM4018) in fase di colonizzazione ed invasione. Contemporaneamente per lo stesso ceppo è stata studiata, mediante RT-qPCR, l'espressione di potenziali geni correlati alla virulenza presenti in Arcobacter spp. (cadF, mviN, irgA, tlyA, cj1349, pldA, hecA, hecB e ciaB) e normalmente impiegati per la rilevazione di specie patogene appartenenti al genere batterico in oggetto. L'esperimento su modelli 2D è stato successivamente effettuato su 32 ceppi di A. butzleri isolati da feci di uomo, cane, cavallo, pecora, pollo, bovino e da campioni fecali e diversi compartimenti intestinali di maiale oltre che da carne di questo animale, al fine di studiare eventuali differenze della capacità di adesione e colonizzazione all'interno della specie e legate alle differenti fonti di isolamento; inoltre analisi molecolari (PCR) sono state effettuate per valutare la presenza dei geni di virulenza. All'approccio molecolare iniziale è susseguita una fase di analisi bioinformatiche in cui, a seguito all'estrazione del DNA, è stato eseguito l'assemblaggio delle sequenze e la successiva annotazione funzionale con il software Prokka oltre ad analisi filogenetiche riguardanti i 32 genomi. Infine, parallelamente all'annotazione funzionale, è stato eseguito uno SNP mining al fine di ricercare SNP presenti dei ceppi in esame rispetto al genoma di riferimento di A. butzleri RM4018 (LMG 10828T). Dagli esperimenti su modelli 2D e successiva analisi molecolare e bioinformatica si evince che tutti i ceppi presi in esame hanno comportamento simile in fase di colonizzazione ed invasione; è emerso, inoltre, che il muco prodotto dalle cellule HT-29 MTX favorisce l'attività di colonizzazione del patogeno. I risultati ottenuti dalla colonizzazione ed invasione dei modelli cellulari hanno permesso di confermare la patogenicità in vitro di A. butzleri nei confronti dell'uomo e di evidenziare uniformità a livello intra-specifico per i fenomeni di virulenza; inoltre l'analisi bioinformatica ha mostrato un parziale raggruppamento filogenetico dei ceppi legati alla fonte di isolamento. I dati ottenuti possono inoltre rappresentare un ottimo punto di partenza per ulteriori indagini, ad esempio tramite studi del trascrittoma con tecniche omiche (ad esempio RNA-seq) che possono approfondire la comprensione dei meccanismi di virulenza messi in atto dal patogeno.