Caratterizzazione di diverse linee cellulari gliali primarie e immortalizzate e ruolo della Neuregulina1 nella migrazione

La rigenerazione nervosa negli ultimi anni è stata oggetto di diversi studi che hanno approfondito le capacità rigenerative del sistema nervoso centrale (SNC) e periferico (SNP). Diverse sono infatti le patologie dovute a traumi o lesioni che possono portare ad un deficit della funzionalità sensoriale o motoria. Fra i diversi approcci sperimentali che vengono utilizzati per cercare di facilitare la rigenerazione nervosa, vi è il trapianto in situ di cellule gliali, quali le cellule di Schwann (SC) e le cellule della glia della guaina olfattiva (OEC). Il nervo olfattivo, infatti, si rigenera continuamente nei mammiferi adulti; la sua capacità rigenerativa è stata attribuita alle cellule gliali della guaina olfattiva, che nascono nella mucosa nasale e migrano verso il bulbo olfattivo. Nel nostro laboratorio abbiamo deciso di caratterizzare queste cellule gliali di origine assai diversa, analizzando sia colture primarie di SC e OEC, sia linee cellulari immortalizzate derivate da questi due tipi cellulari (RT4-D6P2T e NOBEC). Mediante quantitative real time PCR è stata valutata l'espressione di alcuni geni gliali e l'espressione delle diverse isoforme del ligando neuregulina 1 (NRG1), la cui espressione gioca un ruolo fondamentale nei fenomeni di mielinizzazione e di rigenerazione nervosa. Un risultato interessante emerso da questa analisi è che le linee cellulari immortalizzate analizzate rispecchiano i livelli di trascrizione delle rispettive linee cellulari primarie e che le SC e le OEC sono assai diverse fra loro. Le isoforme della NRG1 possono essere solubili (tipo I/II) o transmembrana (tipo III) ed agire in maniera paracrina o juxtacrina. In seguito ad interazione juxtacrina si può attivare una via di segnalazione verso la cellula che esprime il recettore e/o verso la cellula che esprime il ligando. Di solito, nel SNP la NRG1 di tipo III è espressa dagli assoni, ErbB3 (recettore della NRG1) dalle SC. La nostra analisi di espressione dimostra che le OEC e le NOBEC sono caratterizzate (a differenza delle SC) dall'espressione della NRG1-III e dalla mancanza del recettore ErbB3. Ne consegue che la linea cellulare NOBEC risulta essere un buon modello per studiare la segnalazione inversa promossa dalla NRG1-III. Per attivare e studiare questa via di segnalazione abbiamo prodotto e purificato una proteina ricombinante corrispondente al dominio extracellulare del recettore della NRG1 ErbB4 (ecto-ErbB4). In seguito a stimolazione delle cellule NOBEC con ecto-ErbB4 abbiamo osservato un aumento della migrazione cellulare. E' noto dalla letteratura che la NRG1-III, in seguito all'interazione col suo recettore, può rilasciare un frammento citoplasmatico C-terminale che a sua volta può migrare nel nucleo. Abbiamo dimostrato che l'espressione transiente del frammento citoplasmatico della NRG1-III, nativo o privato del segnale di localizzazione nucleare, stimola la migrazione. Questi dati suggeriscono che la NRG1-III stimola la migrazione attraverso una segnalazione di tipo citoplasmatico. Inoltre, abbiamo dimostrato, mediante western blot, che la stimolazione con ecto-ErbB4 attiva una via trasduzionale che porta alla fosforilazione di ERK, senza alterare i livelli di fosforilazione di AKT. L'utilizzo di inibitori delle MAPK ci consentirà di capire se questa via è coinvolta nella migrazione cellulare indotta da ecto-ErbB4.

In the last years, nerve regeneration was the focus of many studies concerning the regenerative capacity of the central (CNS) and of the peripheral nervous system (PNS). Several diseases due to trauma or injuries may lead to sensory or motor function deficits. Among the different experimental approaches used to support nerve regeneration, there is in situ transplantation of glial cells, such as Schwann cells (SC) and olfactory ensheathing cells (OEC). The olfactory nerve continuously regenerates in adult mammals. This regenerative capacity has been attributed to glial cells of the olfactory sheath, which arise in the nasal mucosa and migrate to the olfactory bulb. In our laboratory, we decided to characterize different glial cells, analysing SC and OEC primary cultures and the corresponding immortalized cell lines (RT4-D6P2T and NOBEC). The expression of some glial cell genes and of different isoforms of the ligand neuregulin 1 (NRG1) was analyzed by quantitative RT-PCR. Actually, NRG1 plays a fundamental role in myelination and nerve regeneration. An interesting result emerged from this analysis is that the immortalized cell lines analyzed reflect the transcription level of the respective primary cell lines and that the SC and OEC are very different from each other. The NRG1 isoforms can be both soluble (type I/II) and transmembrane (type III) and signal in a paracrine or juxtacrine manner. Juxtacrine interaction can lead to reverse or forward signaling. Usually, in the PNS NRG1 type III is expressed by axons, ErbB3 (the NRG1 receptor) by SC. Our expression analysis showed that - unlike SC - NRG1 is expressed in OEC and NOBEC while ErbB3, the NRG1 receptor, is not expressed at all. Therefore, NOBEC cell line is a good model to study the NRG1 reverse signaling. In order to study the NRG1 reverse signalling, we produced and purified a recombinant protein corresponding to the extracellular domain of the NRG1 receptor ErbB4 (ecto-ErbB4). After stimulation of NOBEC cells with ecto-ErbB4 we observed an increase of cell migration. It is known from the literature that the NRG1-III, following the interaction with its receptor, may lead to the cleavage of a cytoplasmic C-terminal fragment, which can migrate into the nucleus. We show that the transient expression of the cytoplasmic fragment of NRG1-III - wild type (NRG1-ICD-NLS) or without the nuclear localization signal (NRG1-ICD-ΔNLS) - stimulates migration. These data suggest that NRG1-III stimulates migration through a cytoplasmic signaling. Furthermore, we show, by western blot, that ecto-ErbB4 stimulation activates a signal transduction pathway that leads to the phosphorylation of ERK, without altering AKT phosphorylation. To determine if this pathway is involved in ecto-ErbB4 mediated cell migration, we planned to take advantage of MAPK inhibitors.