Studio dell'effetto del dominio extracellulare di ErbB4 nella rigenerazione nel sistema nervoso periferico

Peripheral nerves show a significant regenerative capacity in adulthood. After nerve injury a permissive environment for the axonal growth is created mainly by the presence of specific signaling molecules, the absorbing of cellular debris and the Schwann cells (SC) disposition as a guiding tube helping to achieve a good tissue re-innervation. But to reach a complete functional recovery, a quick nerve growth and axons re-myelination are necessary. Various surgical technique and medical therapies have been proposed to help the regenerative process and the associated functional recovery during traumatic nerve injury and other peripheral neuropathies. Muscle-in-vein is a recently surgical technique that use a vein filled with skeletal muscle as a non neuronal-conduits sutured with the proximal and the distal edge of the injured nerve. Previous studies from Perroteau and Geuna's laboratories showed that, other than preventing vein collapse, muscle in the graft also promotes the SC invasion and the nerve regeneration. My work focus on the role of the neuregulin 1 (Nrg1), a signaling protein, known for its implication in SC development, that is released by muscle inside the graft. In order to assess the muscle-in-vein efficiency without muscular Nrg1, we designed an in vivo analysis with a recombinant protein able to take away this protein from the vein. In a rat median nerve regeneration experiment, skeletal muscle used in muscle-in-vein has been treated for the release of the extracellular domain of ErbB4 protein, one of Nrg1 receptors (ecto-ErbB4). Functional recovery analysis with grasping test showed unexpected results: animals expressing ecto-ErbB4 had an earlier and better recovery compared to the control group. A morpho-quantitative analysis was performed on distal section of median nerve three months after surgery: we detected a significant decrease in g-ratio value (the ratio between axon diameter and fiber diameter) in animals treated with ecto-ErbB4. This data suggests a better fibers myelination in treated animals respect to the control ones. To assess the role of ecto-ErbB4 in myelination we performed an in vitro myelination assay with dorsal root ganglion neurons from rat embryos, co-cultured with primary rat SC. Recombinant protein ecto-ErbB4 was produced in vitro and addicted to myelination medium. After 14 days of co-culture we carried out a immunofluorescence analysis which revealed the presence of positive SC for MBP (myelin basic protein) aligned along axons and in close association with them, both in treated samples and in controls. A real-time PCR analysis on co-cultures showed an increase in expression levels of some genes associated with myelination, Sox10 and MBP. However, no difference was detected between treated samples and controls. The unexpected ecto-ErbB4 activities in vivo may be due to transactivation of ErbB2 receptor on SC, stimulating migration and proliferation of these cells. Otherwise, ecto-ErbB4 could bind axonal transmembrane Nrg1 activating a ¿reverse¿ signaling in neuronal cells with positive effects on the regenerative process. A morphological analysis performed at an early stage of nerve regeneration could give new elements for a good comprehension of the role played by ecto-ErbB4. In addition, more information could be achieved from in vitro analysis about ecto-ErbB4 interaction with other members of Nrg1/ErbB signaling systems.

I nervi periferici mantengono nell'adulto un'elevata capacità di rigenerazione. In seguito a danno nervoso si genera un ambiente permissivo per la crescita assonale, grazie alla presenza di specifiche molecole di segnalazione e all'azione delle cellule di Schwann (SC) che favoriscono l'eliminazione dei detriti cellulari e generano una struttura tubulare di guida. La crescita in tempi brevi e la ri-mielinizzazione delle fibre rigenerate sono necessarie perché vi sia un recupero funzionale completo. L'alta incidenza di neuropatie che colpiscono la popolazione ha spinto alla ricerca di nuove tecniche chirurgiche e terapie mediche che favoriscano la rigenerazione nervosa e il recupero funzionale. Una tecnica recente è rappresentata dal muscolo-in-vena, che prevede l'inserimento tra le due estremità recise del nervo di una struttura tubulare formata da una vena riempita con delle fibre muscolari. Studi eseguiti nei laboratori dei Prof. Perroteau e Geuna hanno dimostrato come il muscolo dell'innesto, oltre ad avere una funzione di sostegno, favorisca la colonizzazione da parte delle SC e quindi la rigenerazione. Il mio lavoro di tesi s'inserisce nell'analisi dell'ipotesi che questo effetto sia legato al rilascio da parte del muscolo della neuregulina 1 (Nrg1), una proteina di segnalazione cellulare conosciuta per il suo coinvolgimento nello sviluppo delle SC. Per valutare l'efficacia della tecnica del muscolo-in-vena in assenza della Nrg1 rilasciata dal muscolo, è stata progettata un'analisi in vivo in presenza di una proteina ricombinante che sequestra la Nrg1. A tal fine, in un esperimento di rigenerazione del nervo mediano di ratto, è stata fatta esprimere nelle fibre muscolari da utilizzare per il muscolo-in-vena la porzione extracellulare di ErbB4, recettore della Nrg1 (ecto-ErbB4). L'analisi del recupero funzionale negli animali tramite grasping test ha mostrato, però, risultati inattesi: gli animali esprimenti ecto-ErbB4 hanno un recupero anticipato e migliore rispetto al controllo. Su sezioni dei nervi rigenerati posti distalmente all'innesto è stata eseguita un'analisi morfo-quantitativa: la g-ratio (rapporto tra il diametro dell'assone e il diametro della fibra) risulta significativamente più bassa negli animali trattati con ecto-ErbB4, indicando che le fibre sono meglio mielinizzate rispetto ai controlli. Per valutare la possibile azione di ecto-ErbB4 nel processo di mielinizzazione è stato messo a punto un saggio di mielinizzazione in vitro su gangli embrionali della radice dorsale di ratto dissociati e messi in co-coltura con SC primarie. È stata prodotta in vitro la proteina ricombinante ecto-ErbB4 aggiunta poi al terreno di mielinizzazione. Dopo 14 giorni di co-coltura è stata eseguita un'analisi d'immunofluorescenza che rivela la presenza di SC positive alla marcatura di MBP (myelin basic protein) allineate lungo gli assoni e in stretta associazione con essi sia nei campioni trattati che nei controlli. Con un'analisi in real-time PCR delle co-colture si è evidenziato un aumento di espressione di Sox10 ed MBP, geni legati alla mielinizzazione. Tuttavia, non si notano differenze tra i campioni trattati con ecto-ErbB4 ed il controllo. L'azione di ecto-ErbB4 in vivo potrebbe essere dovuta alla transattivazione di ErbB2 sulle SC, con conseguente aumento della migrazione e della proliferazione, oppure all'interazione con la Nrg1 transmembrana presente sull'assone e l'attivazione di una segnalazione ¿inversa¿ nella cellula neuronale.