Nuovi sistemi di lettura automatizzata di preparati per immunofluorescenza indiretta nel laboratorio di autoimmunità

My work in the autoimmunity laboratory at the Central Laboratory of Chemical Clinical Analyses ¿Baldi e Riberi¿ of Turin's A.S.O. San Giovanni Battista was to evaluate the introduction of an automated system for the reading and the interpretation of fluoroscopic patterns on cells or tissues slides. Autoimmunity is defined as the immunity response to autologous antigens; it is a very important cause of clinical-pathological alterations. Autoimmune diseases are classified in 3 groups: organ-specific or systemic autoimmune diseases, intermediate and specific. To sustain the clinical diagnosis of an autoimmune disease the main laboratory research is to search specific autoantibodies on indirect immunofluorescence slides. Main autoantibodies are: anti-nuclear antibodies (ANA) search on Hep-2 cells; anti-gastric parietal cell antibodies (APCA), anti-intrinsic factor antibodies, anti-smooth muscle antibodies (ASMA), anti-liver/kidney microsomal antibodies (LKM) search on rat kidney/liver/stomach sections; anti-endomysial antibody (EMA) search on primate esophagus sections. At ¿Baldi e Riberi¿ before June 2012 there was an automated instrument to process slides called ZENIT, and the slides were read whit a manual fluorescence microscope, the Nikon Eclipse 55i. After June 2012 the instrumentation is changed: to prepare the slides is used the IF Sprinter and for the reading is used an automated microscope, EUROPattern. It has software for the automatic acquisition and interpretation of fluoroscopic patterns. There are three types of slides which, when positives, have typical patterns. A positive EMA pattern shows a honeycomb wire-like fluorescence surrounding the smooth muscle fibres. On the tissues slides we can recognize different patterns: ASMA, AMA, APCA, LKM. The Hep-2 cells can have different patterns depending on the anti-nuclear antibodies: homogeneous, speckle, centromeric, nucleolar, multiple nuclear dots, ribosomal, mitochondrial, centrosomic. To evaluate the introduction of this new microscope I considered the different analytic phase, analyzing the difference with the former method. I analyze the difference about the various phase schedule, the number of samples and slides, the subjective operator participation, the different connection with the managerial PC, the medical report handling. This research has demonstrated that the introduction of the automated microscope enabled to reach a certain level of standardization thanks to the lesser intervention of the operator. The EUROPattern is useful to decrease the analytic phase time and to distinguish between ANA positives and negatives. The laboratory staff can concentrate its attention on positives, using the microscope interpretation as a guide. Its limit is that we can have an interpretation only for ANA slides, not for EMA and tissues slides. In the future it will be possible to come through this limit by an integration of information in the microscope server.

Il mio lavoro presso il laboratorio di autoimmunità presso il Laboratorio Centrale di Analisi Chimico Cliniche ¿Baldi e Riberi¿ dell'A.S.O. San Giovanni Battista di Torino è stato quello di valutare l'inserimento di un sistema automatizzato per la lettura e l'interpretazione dei quadri fluoroscopici ottenuti su preparati di cellule o tessuti. L'autoimmunità si definisce come la risposta immunitaria nei confronti di antigeni autologhi; rappresenta una causa molto importante di alterazioni clinico-patologiche. Le malattie autoimmunitarie vengono classificate in tre grandi gruppi: malattie autoimmuni non organo-specifiche o sistemiche, intermedie e specifiche. Le principali indagini di laboratorio che possono orientare o confermare la diagnosi clinica di malattia su base autoimmunitaria sono rappresentate dalla ricerca degli autoanticorpi specifici su vetrini per immunofluorescenza indiretta. I principali autoanticorpi ricercati sono: gli autoanticorpi anti-nucleo (ANA) ricercati su cellule HEp-2; anticorpi anti-cellule parietali gastriche (APCA), anticorpi anti-fattore intrinseco, anticorpi anti-muscolo liscio (ASMA), anticorpi anti-microsomi del fegato e del rene ricercati su sezioni di fegato/rene/stomaco di ratto; anticorpi anti-endomisio (EMA) ricercati su sezioni di esofago di scimmia. Presso il ¿Baldi e Riberi¿ prima del giugno 2012 era in uso uno strumento automatizzato per l'elaborazione di vetrini chiamato ZENIT, i vetrini così preparati venivano letti con un microscopio a fluorescenza manuale, il Nikon Eclipse 55i. Dopo il giugno 2012 la strumentazione è cambiata: per preparare i vetrini è in uso l'IF Sprinter e per la lettura viene utilizzato un microscopio automatizzato, l'EUROPattern, dotato di un software per l'acquisizione e l'interpretazione automatica dei pattern fluoroscopici nella diagnostica autoimmune. Sono preparate tre tipologie di vetrini che, quando positivi, presentano dei pattern caratteristici. Un pattern EMA positivo mostra una fluorescenza a nido d'ape dell'endomisio della muscolaris mucosae dell'esofago di scimmia. Sui vetrini con diversi tessuti in base alla zona di fluorescenza, si possono riconoscere diversi pattern: ASMA, AMA, APCA, LKM. Le cellule HEp-2 possono mostrare pattern diversi in base al tipo di anticorpo anti-nucleo: omogeneo, granulare, centromerico, nucleolare, multiple nuclear dots, ribosomiale, mitocondriale, centrosomico. Per valutare l'inserimento di questo nuovo microscopio ho preso in considerazione le varie fasi analitiche, andando ad analizzare le differenze con il metodo precedente. Ho analizzato le differenze riguardanti le tempistiche delle varie fasi, il numero di campioni processati e vetrini utilizzati, l'intervento soggettivo dell'operatore, i diversi collegamenti con il PC gestionale, la gestione della refertazione. Il risultato dell'indagine condotta ha dimostrato che l'inserimento del microscopio automatizzato ha permesso di raggiungere un certo livello di standardizzazione grazie al minor intervento dell'operatore. L'EUROPattern è utile per la riduzione dei tempi della fase analitica, e per discriminare tra gli ANA positivi e negativi. L'operatore si può concentrare sui positivi, considerando l'interpretazione fornita dallo strumento come guida. Per ora il suo limite è che può interpretare solo i vetrini per gli ANA e non i vetrini EMA e tessuti. Si spera di poterlo superare in futuro con un'integrazione di informazioni nel server a lui collegato.