Catecolo 1,2-diossigenasi IsoB da Acinetobacter radioresistens: investigazione delle proprietà e della specificità al substrato di tre nuovi mutanti

Catechol 1,2-dioxygenase (C1,2-DO) is a homodimeric cytosolic enzyme expressed both in Gram positive and Gram negative bacteria. Of the two existing isoforms in Acinetobacter radioresistens S13, IsoA and IsoB (different for molecular weight and expression conditions), IsoB is the isoenzyme in this project. Each monomer (36800 Da) is made up of two domains: an α-helical domain involved in dimerization and a catalytic one (mainly based on a β-sandwich), containing a Fe(III) atom penta-coordinated by two tyrosines, two histidines and a water molecule. Recent crystallography studies highlighted the presence of two phospholipids, one per monomer, whose function has not been clarified yet, even if they are supposed to have an inhibitory effect on the catalysis. C1,2-DO is involved in the so called β-ketoadipate pathway, in which aromatic and toxic compounds are degraded into non-cyclic molecules which undergo TCA; in particular the enzyme catalyses the conversion of catechol, a benzene with two hydroxyl groups in position 1 and 2, into cis,cis-muconic acid, by breaking the aromatic ring and inserting the atoms of the molecular oxygen. Three mutants were produced by site directed mutagenesis: two single mutants (C1,2-DO I101A and I101G) and a double mutant (C1,2-DO L69A/I101A). Recombinant plasmid pET 30-a (+) was propagated in E. coli DH5α competent cells, sequenced to verify the absence of undesired mutations and used to transform E. coli BL21 (DE3) competent cells in order to get a good amount of protein of interest. All mutants and the WT were purified by a double step purification: anionic exchange chromatography and affinity chromatography, resulting in good amounts of very pure. Because of C1,2-DO role in bioremediation, different pollutant chlorinated and methylated catechols were investigated as possible substrates for mutants: kinetic parameters KM and kcat were calculated for each promising molecule by fitting data to the Michaelis-Menten model. The introduced mutations have no destabilising effect on the active site: mutants still metabolize catechol with efficiency comparable to the WT confirming the correct assembly of the catalytic Fe(III), in accordance with the similarity of the spectral features in the 430 nm region. As for substituted catechols, 4-chlorocatechol is well metabolized by C1,2-DO I101A, whose efficiency is far increased when compared to the WT, meaning the Ile-to-Ala substitution enlarges the catalytic pocket to host a bulkier substrate without disrupting protein structure. This mutant shows also a good activity towards methylated catechols, in particular 3-methylcatechol and 4-methylcatechol. C1,2-DO I101G presents activity towards 3-methylcatechol, but no activity was observed towards catechols substituted in position 4: probably the glycine creates a space in the active site which is too big and destabilizes the interactions between the enzyme and these bulky substrates. Double substituted catechols 3,5-dichlorocatechol and 3,5-di-tert-butylcatechol were tested on C1,2-DO L69A/I101A: these substrates are very recalcitrant and hardly soluble molecules, in fact the mutated enzyme shows no activity towards them. Further point mutations in the active site could be studied in order to find out mutated enzymes able to metabolize bulky and pollutant substituted catechols (i.e. deriving from olive oil mill, paper producing industries, lignin degradation) for applicative detoxification or carbon sources recovery.

La catecolo 1,2-diossigenasi (C1,2-DO) è un enzima citosolico omodimerico espresso in batteri sia Gram+ che Gram-. Delle due isoforme esistenti in Acinetobacter radioresistens S13, IsoA e IsoB (diverse per peso molecolare e condizioni di espressione), IsoB è l'isoforma in questo progetto. Ogni monomero (36800 Da) è composto da due domini: un dominio α-elica impegnato nella dimerizzazione e un dominio catalitico (basato su foglietti β), contenente un atomo di Fe(III) pentacoordinato da due tirosine, due istidine e una molecola d'acqua. Recenti studi di cristallografia evidenziano la presenza di due fosfolipidi, uno per monomero, la cui funzione non è ancora stata chiarita, anche se si suppone inibiscano la catalisi. C1,2-DO partecipa alla via del β-chetoadipato, in cui composti aromatici sono degradati a molecole non cicliche che entrano nel TCA; l'enzima catalizza la conversione del catecolo, un benzene con due idrossili in posizione 1 e 2, in acido cis,cis-muconico, rompendo l'anello aromatico e inserendo gli atomi dell'ossigeno molecolare. Tre mutanti sono stati prodotti per mutagenesi sito-specifica: due mutanti singoli (I101A e I101G) e un doppio mutante (L69A/I101A). Il plasmide ricombinante pET 30-a(+) è stato propagato in cellule competenti DH5α di E. coli, sequenziato per verificare l'assenza di mutazioni indesiderate e usato per trasformare cellule competenti BL 21(DE3) di E. coli per ottenere una buona quantità di proteina d'interesse. I mutanti e il WT sono stati purificati prima con una cromatogafia per scambio anionico, poi con una cromatografia per affinità, per una buona resa di enzima purificato. Per il ruolo della C1,2-DO nel biorisanamento, catecoli inquinanti clorurati e metilati sono stati studiati come possibili substrati: i parametri cinetici KM e kcat sono stati calcolati per ogni molecola promettente elaborando i dati ottenuti col modello di Michaelis-Menten. Le mutazioni introdotte non destabilizzano il sito attivo: i mutanti metabolizzano ancora il catecolo con buona efficienza confermando il corretto assemblaggio del Fe(III) catalitico, in accordo con la similarità tra gli spettri nella regione dei 430 nm. Per quanto riguarda i catecoli sostituiti, il 4-clorocatecolo è ben metabolizzato da I101A, la cui efficienza è maggiore confrontata con il WT, indicando che la sostituzione Ile->Ala allarga la tasca catalitica per ospitare un substrato più ingombrante senza danneggiare la struttura proteica. Il mutante mostra buona attività verso i catecoli metilati, in particolare il 3- e il 4-metilcatecolo. I101G mostra attività verso il 3-metilcatecolo, assente nei confronti dei catecoli sostituiti in posizione 4: : probabilmente la glicina allarga troppo il sito attivo e destabilizza le interazioni tra l'enzima e questi substrati ingombranti. I catecoli doppiamente sostituiti 3,5-diclorocatecolo e 3,5-di-tert-butilcatecolo sono stati testati su L69A/I101A: tali molecole sono molto recalcitranti, infatti l'enzima non mostra attività verso di essi. Ulteriori mutazioni nel sito attivo potrebbero essere studiate per trovare enzimi capaci di metabolizzare catecoli sostituiti ingombranti e inquinanti (ad esempio derivanti dai frantoi,dalle industrie cartacee, dalla degradazione della lignina) per applicazioni in processi di detossificazione o recupero di fonti di carbonio. In questo lavoro si osserva in I101A attività enzimatica verso il guaiacolo, metabolita aromatico derivate dalla degradazione della lignina.