Establishment of the method for protoplasts-based gene editing in Cichorium intybus

Cichorium intybus L. is a medicinal and industrial plant of the Asteraceae family which produces high numbers of sesquiterpene lactones (STLs) with antinutritive, antimicrobic, anthelmintic, nematocidal, antifungal and antimalarial properties. The lactone ring confers the bitter taste. Chicory's main industrial usage is the extraction of inulin, a plant storage carbohydrate valuable as dietary fiber and sweetener, but its isolation process is hampered by STLs co-extraction. For this reason, a quick method to control STLs pathway in chicory is required. One of the CHIC project aims, funded by the EU Horizon 2020 program, is the development of plants for inulin extraction or with scaled ranges of STLs (and therefore bitterness) for different consumer tastes. This thesis project was carried out in this context. The CRISPR/Cas9 system is widely applied to modify quickly and precisely the plant genome, exploiting the natural repair systems of plants with low off-targets events. This technique can be coupled with an efficient protocol to deliver the construct(s) (or in vitro transcribed ribonucleoproteins RNPs) to the protoplasts, in order to regenerate non-chimeric plants. This innovative protocol involves the embedding of the protoplasts (Cichorium intybus var. Orchies) in a thin layer of alginate. Two different osmolarities lines of culture medium were tested to understand their hypothetical influence on the growth. These lines were tested also for different refreshment gaps, with the objective of reducing the time spent by the operator following the regeneration process, lowering costs. The protocol obtained was then tested for transfection using the Green Fluorescent Protein visual system. Two DNA concentrations were evaluated, including also two controls: one subjected to the same steps, but with H2O (W), and one just as growth control (GC) to monitor the PEG treatment impact. The two checked osmolarities were comparable from day 8 onwards, both reaching 95% of dividing cells at day 12. The refreshment gap test showed a statistically significant difference: the less refreshed line showed a higher number of shooting calli in both osmolarities, reducing time and labor required with better results. At week 16 about 50% of calli were shooting (peaks of 58%). GFP transfection was also successful: it was transiently expressed for 10 days (at day 5, 56% of cells showing GFP), and at day 15 it was no longer visible in any line. The loss of GFP is desirable, especially in terms of DNA-free plants, because it could indicate no integration in the genome. Both controls were not showing GFP, as expected. GC line results were comparable with the ones obtained during the protocol setting, deducing that PEG treatment does not influence the dividing rates (98% dividing cells at day 15). Protoplasts are usually cultured in liquid or solid medium, while embedding them in a thin layer of alginate ensures a safer refreshment without stress, avoiding toxic compounds collection and allowing gas exchange with the medium. The protocol requires more testing with the CRISPR/Cas9 method for another visual system: the phytoene desaturase (PDS) knock-out. Two guide RNA were designed to target the CiPDS fifth exon. Three delivery system were hypothesized: single plasmid, two plasmids co-transfection and RNPs. These last were also intended to screen the mutant. The protocol can be further applied to modulate terpene pathway in chicory.

Cichorium intybus L. è una pianta della famiglia delle Asteraceae. Produce un'ampia gamma di sesquiterpeni lattonici (STLs) con proprietà antimicrobiche, antielmintiche, nematocide, antifungine e antimalariche. L'amarezza tipica è data dall'anello lattonico. Tuttavia, il principale uso industriale della cicoria è l'estrazione di inulina, polisaccaride di riserva impiegato come dolcificante e additivo. Il processo di estrazione è ostacolato dalla coestrazione dei STLs, rendendo necessario un metodo rapido per la regolazione di questa via metabolica. Fra gli obiettivi del progetto CHIC, finanziato dal programma EU Horizon 2020, vi è la creazione di piante per l'estrazione di inulina e di altre con livelli di amarezza variabile, in funzione dei diversi mercati. Il sistema CRISPR/Cas9 è adottato per introdurre modifiche puntuali al genoma, sfruttando i meccanismi naturali di riparazione dello stesso con bassi effetti off-target. Questa tecnica, abbinata a un protocollo efficiente per introdurre il costrutto (o direttamente ribonucleoproteine RNPs) in protoplasti, permette di rigenerare piante non chimeriche. Il protocollo sviluppato prevede l'incapsulamento dei protoplasti di cicoria in un disco sottile di alginato. Sono state saggiate due linee di terreni di coltura con osmolarità differenti, per valutarne l'influenza sulla rigenerazione. Altro parametro considerato è stato l'intervallo di rinfresco dei mezzi di coltura, con l'obiettivo di ridurre il tempo dedicato alla rigenerazione dall'operatore, così da abbattere i costi. Il protocollo ottenuto è stato valutato per la trasfezione tramite il sistema di visualizzazione Green Fluorescent Protein (GFP), includendo due concentrazioni di DNA e due controlli: uno soggetto agli stessi passaggi, ma con H2O (W) e uno solo per la crescita (GC), così da valutare l'impatto del PEG. Le osmolarità valutate sono comparabili: 95% di cellule in divisione al giorno 12. L'intervallo di rinfresco ha dato risultati statisticamente significativi: la linea rinfrescata meno mostra un maggior numero di germogli in entrambe le osmolarità, riducendo tempi e lavoro richiesto, con risultati migliori. Alla settimana 16, il 50% dei calli era germogliante (picchi del 58%). Anche la trasfezione con GFP ha dato risultati positivi, mostrando espressione transiente per i primi 10 giorni (con picchi pari al 56%), con perdita di fluorescenza entro due settimane. Questo risultato è ricercato nell'ottica di piante DNA-free, indicando la mancata integrazione nel genoma. I risultati delle linee GC e W sono comparabili fra loro e con il primo esperimento, portando alla conclusione che il PEG non limita la crescita cellulare. In genere, i protoplasti vengono coltivati in mezzi liquidi o solidi: racchiuderli in sottili dischi di alginato ha il vantaggio di ridurne mobilità e stress, oltre a garantire lo scambio di gas con il mezzo liquido in cui è immerso per le prime settimane, assicurando un rinfresco più semplice e limitando l'accumulo di sostanze tossiche. Il protocollo richiede ulteriori test con CRISPR/Cas9, effettuando il knock-out del gene della fitoene desaturasi. Sono stati progettati due RNA guida con obiettivo il quinto esone e ipotizzati tre sistemi: uno a plasmide singolo, la co-trasfezione di due plasmidi e l'inserimento diretto di RNPs. Queste ultime fungerebbero anche da sistema di screening dei mutanti. Il protocollo può essere applicato per indagare i metabolismi in C. intybus.