Impiego del sistema CRISPR/Cas9 per la messa a punto di tecniche di genome editing OGM-free in Vitis vinifera

La fitoene desaturasi (PDS) è un enzima coinvolto nella biosintesi dei carotenoidi nelle piante e nei cianobatteri. Molti studi hanno dimostrato che il suo knock-out ha come conseguenza un fenotipo albino, permettendo di avere un 'visual system' dell'editing. In questo lavoro lo scopo è stato quello di utilizzare questo sistema per la messa a punto di un protocollo di genome editing in vite che permetta di rigenerare piante editate per la modificazione d'interesse. Al fine di raggiungere tale scopo, sono stati utilizzati due approcci differenti per effettuare editing: uno che utilizza Agrobacterium tumefaciens per l'inserimento del costrutto necessario, e l'altro che si basa sulla trasfezione dei protoplasti mediata da CRISPR con ribonucleoproteine preassemblate Cas9-gRNA, permettendo di ottenere piante OGM-free. Nella tecnica tradizionale, i sgRNA disegnati sul gene della fitoene desaturasi sono stati inseriti in un costrutto contenente il gene per la Cas9 e il marker di selezione NptII per la kanamicina, utilizzando il sistema di clonaggio GoldenBraid. Per quanto riguarda l'approccio di genome editing OGM-free, è stato messo a punto un protocollo per la rigenerazione di piante da protoplasti. Inoltre, i protoplasti sono stati trasfettati mediante PEG, prima della messa in coltura, con proteina pura Cas9 e sgRNA disegnati sul gene pds, nel tentativo di mettere a punto un protocollo di rigenerazione di piante editate.