Manipolazione genetica di microalghe (Chlorophyceae) per l'ingegneria metabolica dei terpeni

Microalgae are a wide phylogenetically different organisms; it has been estimated than at least 1 million of microalgae species exists. They have been classified either in prokaryotes (cyanobacteria) and eukaryotes, the latter including brown, red and green microalgae. As photosynthetic organisms they convert light energy and CO2 into biomass and primary metabolites, mainly carbohydrates; therefore, they are the most abundant primary unicellular producers in any aquatic environments. In addition, some species have colonised environment niches exerting extreme conditions, such as low and high pH and temperature, anaerobiosis, high salinity. Due to their metabolic adaptation and the flexibility to grow in several environments, microalgae are used as source of high quality proteins, fatty acids, vitamins, pigments, antioxidants, as well as therapeutic agents for the enhancement of immunity system and other compounds useful in medical research. So far, 100.000 different chemical compounds have been discovered in microalgae. These compounds belong mainly to the chemical family of isoprenoids, alkaloids, and polyunsaturated fatty acid. Among them, triterpene molecules have received a major scientific interest due to their use for human health, pharmacological properties and in synthetic chemistry. However, the poor knowledge on the pathway of triterpenes in microalgae reduces the application of metabolic engineering approaches. In this contest, a biotechnology project has been started in the Plant and Microalgae Biotechnology Laboratory at the University of Naples Federico II, Department of Agricultural Sciences, in order to study the modification of terpenes profile induced by the xenogenic expression of an oxidosqualene cyclase (AsOXA1) isolated from Aster sedifolius. In plants, AsOXA1 is the key enzyme involved in the production of β-amyrin starting from squalene. β-amyrin is a valuable compound due to its pharmacological properties. Squalene in present in microalgae but the absence of an AsOXA1-like enzyme impairs the production of β- amyrin. Indirect nuclear genetic transformation was performed in microalgae species belonging to Botryococcus, Chlamydomonas, Chlorella and Scenedesums genera by using a binary expression vector bearing the AsOXA1 gene under the constitutive promoter CaMV35S. Resistant microalgae colonies were detected after 14 days of cultivation on selective medium. In order to reduce the escape, putative transgenic colonies from each accession were inoculated into liquid selective medium; furthermore, PCR analysis were carried out on colonies grown in that medium. Positive PCR results were obtained, thus confirming the stable integration of AsOXA1 into microalgae genomes. Transgenic strains will be further analysed in order to compare their terpenes profile with the untransformed one and to check the presence of β-amyrin or other terpenes not biosynthesised by wild type microalgae species.

Le microalghe sono organismi vegetali acquatici, unicellulari, sia fotosintetici sia eterotrofi che possono viere singolarmente o in colonie. Costituiscono un gruppo molto eterogeneo di microrganismi che possono essere allevati in mezzi acquosi in diverse condizioni, dalle acque dolci a condizioni estreme di salinità. Grazie alla loro capacità di utilizzare la CO2 presente nell'ambiente e alla variabilità nella loro composizione biochimica, rappresentano una potenziale fonte di biomassa per la produzione di numerose molecole di elevato interesse commerciale. Inoltre, essendo caratterizzate da un alto contenuto lipidico,possono rappresentare la materia prima per la produzione di idrocarburi, rendendoli microrganismi particolarmente adatte alla produzione di biouel . Tra i composti lipidici, assume particolare rilevanza la grande produzione di terpeni, biomolecole la cui struttura è caratterizzata dalla ripetizione di unità isopreniche a 5 atomi di carbonio e che, da un punto di vista chimico, possono essere lineari, ciclici o a struttura mista. Di conseguenza,a partire dalla molecola di partenza, isoprene (C5), possiamo ottenere molecole con un numero multiplo di atomi di carbonio, come: monoterpeni (C10), sesquiterpeni (C15), diterpeni(C20), triterpeni(C30) e tetra terpeni(C40) L' obiettivo di questo progetto di tesi è stato l'ottenimento di ceppi algali appartenenti alla classe delle Chlorophyceae contenenti il gene oxa1 isolato da Aster sedifolius,mediante approcci di ingegneria genetica, al fine di ottenere un accumulo di saponine triterpeniche da poter impiegare nella produzione di biocarburanti algali. La trasformazione dei ceppi algali è stata effettuata con metodo indiretto, mediata cioè da Agrobcterium tumefaciens, con l'utilizzo di un costrutto contenente il gene oxa1 sotto il controllo di un promotore costitutivo, il 35S del CaMV. La trasformazione indiretta infatti, permetterebbe l'integrazione stabile di un basso numero di copie del transgene. Per la selezione delle cellule sottoposte ad eventi di trasformazione genetica nucleare che hanno ricevuto il vettore, vengono utilizzati geni di selezione pre-inseriti nel vettore. Questi geni definiti marcatori, conferiscono alle cellule trasformate resistenza ad agenti selettivi tossici, come antibiotici ed erbicidi Le analisi molecolari preliminari condotte sulle putative alghe trasformate hanno dimostrato l'avvenuta trasformazione di alcuni ceppi algali, i quali sono stati anche sottoposti ad analisi biochimiche mediante HPLC e gas cromatografia pr la caratterizzazione del profilo triterpenico. I risultati positivi della trasformazione in alcune accessioni, lasciano intravedere una possibile ingegnerizzazione della via metabolica dei triterpeni in microalghe, aprendo la strada a nuove applicazioni biotecnologiche per la produzione di biocombustibili