Caratterizzazione dell'attacco e ingresso degli adenovirus enterici umani 40 e 41 in differenti cellule epiteliali

Human adenoviruses (HAdVs) are very common viruses spread among all the population worldwide, whose pathologies and infection mechanisms, including entry modalities and binding receptors, differ based on HAdV species or even serotype. HAdV species F includes two only serotypes, 40 (AdV40) and 41 (AdV41), also called “enteric adenoviruses” (EAdVs) due to their specific and restricted tropism to the gastrointestinal tract. In fact, AdV40 and 41 infections are one of the major causes of acute gastroenteritis (AGE), particularly in young children, in which it produces prevalently diarrhea, and represent one of the major sources of morbidity and mortality especially in developing countries. Despite this, AdV40 and 41 are yet largely uncharacterized for the viral and cellular factors which mediate virions attachment and entry pathways in gut epithelial cells compared to other well-studied HAdVs. Indeed, the available data indicate that EAdVs show a distinctive slow kinetics of infection in the most commonly used in vitro cell models. However, the molecular basis of this behavior are not yet defined. Moreover, the entry mechanism used by EAdVs in the infection of the natural host remains unknown. In this thesis, two different model cell lines were employed to investigate the attachment and entry phases of AdV40, AdV41, and AdV5 as a control (one of the most studied respiratory HAdV serotypes): the epithelial pulmonary A549 and the epithelial intestine-derived HuTu80. In this cell lines, the entry of labeled viruses with Alexa Fluor-488 (AF488) was analyzed using small molecules inhibitors of specific cellular factors to test different endocytic pathways. The results obtained confirmed the slow binding kinetics of EAdVs to pulmonary epithelial A549 cells, and a differential behavior in HuTu80 cells for which an increased rate of infection was observed at the same binding time points, with linear trends instead of exponential. With the use specific viral entry assays using different pH buffers or NH4Cl treatment, EAdVs entry, but not attachment, was affected by low pH exposure, and seemed to be independent from endosomes acidification. AF488-labeled EAdVs then showed faster kinetics of entry in HuTu80 cell compared to A549 cell, and appeared to use clathrin-mediated related factors for entry in the intestinal cell line, since the inhibitors pitstop2, dynasore and cytochalasin-D reduced the entry of AdV40 and AdV41 in HuTu80 cell line. Together, the results of this thesis provide novel insights in the understanding of EAdVs entry mechanisms in intestinal epithelial cells.

Gli Adenovirus umani (HAdVs) sono virus molto comuni e diffusi a livello globale, con patologie e meccanismi d’infezione, tra cui le modalità di ingresso e utilizzo di recettori cellulari che differiscono in base alla specie e sierotipo. La specie F degli HAdVs comprende due soli sierotipi, 40 (AdV40) e 41(AdV41), chiamati anche “adenovirus enterici” (EAdVs) per il loro specifico e ristretto tropismo gastrointestinale. Infatti, le infezioni da AdV40 e 41 sono una delle maggiori cause di gastroenterite acuta, in particolare nei bambini piccoli nei quali si manifesta prevalentemente con diarrea, che costituisce una delle principali fonti di morbidità e mortalità nei Paesi in via di sviluppo. Ciò nonostante, i recettori cellulari, i fattori virali e cellulari che concorrono all'attacco dei virioni alle cellule, e i meccanismi di ingresso di AdV40 e AdV41 rimangono ancora poco definiti rispetto a altri HAdV più studiati. In effetti, gli EAdVs presentano una cinetica di infezione lenta nelle linee cellulari comunemente utilizzate in vitro, i cui motivi non sono stati ancora ben definiti. Inoltre, il meccanismo di ingresso utilizzato per infettare le cellule bersaglio nell'infezione nell'ospite naturale rimane da definire. In questa tesi, si sono impiegate due diverse linee cellulari modello: la linea epiteliale di polmone A549 e la linea epiteliale di origine intestinale HuTu80 per investigare la diversa cinetica di legame e internalizzazione di AdV40, AdV41 e come controllo AdV5 (uno dei sierotipi HAdV respiratori più studiati). In queste linee cellulari si è analizzato il meccanismo di entrata virale impiegando inibitori di specifici fattori cellulari d’ingresso e AdVs marcati con AlexaFluor-488 (AF488). I risultati ottenuti confermano una lenta cinetica di legame e internalizzazione per i due EAdVs nelle cellule epiteliali di origine polmonare, A549, ma anche un comportamento diversificato nelle cellule epiteliali HuTu80, mostrando un incremento dell’infezione dopo gli stessi intervalli di tempo, ma con andamento lineare invece che esponenziale. In saggi specifici di entry virale associati al trattamento con tamponi acidi o con NH4Cl, l’internalizzazione degli EAdV, ma non il loro adsorbimento alle cellule bersaglio, sembra essere influenzata da esposizione al pH acido, e indipendente dall’acidificazione degli endosomi,. Gli EAdVs marcati con AF488 hanno poi mostrato una cinetica di entrata più veloce nelle cellule HuTu80 rispetto alle A549, e per l’ingresso nella linea intestinale sembrano utilizzare fattori coinvolti nell’endocitosi mediata da clatrina quanto gli inibitori pitstop2, dynasore e cytochalasin-D inibiscono l'entrata di AdV40 e AdV41 nelle cellule HuTu80. In conclusione, i risultati di questo lavoro di tesi forniscono un nuovo contributo alla comprensione dei meccanismi di entrata degli EAdVs nelle cellule epiteliali intestinali.