Analisi proteomica per l'identificazione di geni coinvolti nella risposta a stress UV-C in carciofo (Cynara cardunculus var. scolymus).

INTRODUZIONE Il carciofo è una specie di interesse agronomico coltivata in tutto il mondo e di cui l'Italia è il primo produttore a livello globale. Questa specie è particolarmente ricca di composti antiossidanti che: i) prevengono danni, causati da radicali liberi nei confronti di molecole biologiche (proteine, lipidi e DNA), ii) esercitano un'azione epatoprotettiva e coleretica, e iii) possono contribuire alla prevenzione di malattie vascolari (e.g.: arteriosclerosi). Tali proprietà terapeutiche sono riconducibili alla presenza di composti derivanti dal metabolismo dei fenilpropanoidi quali i flavonoidi e, in particolare, gli acidi mono e di-caffeoilchinici (CQA e dCQA). Presso il settore genetica Agraria (DIVAPRA), negli ultimi anni, sono stati isolati e caratterizzati funzionalmente la maggior parte dei geni coinvolti nella sintesi dei CQAs ed è stato messo a punto un protocollo di induzione di questi metaboliti basato sull'irradiazione con UV-C (265 nm). OBIETTIVI DELLA TESI 1) Analisi dell'effetto della radiazione UV-C sul proteoma fogliare di carciofo, utilizzando la tecnica 2-D DIGE (Differential in Gel Electrophoresis) in un esperimento ¿time-course (a 6, 12, 18, 24 ore dopo lo stress). 2) Identificazione dei geni regolati da UV-C coinvolti nella risposta abiotica e in particolare coinvolti nell'aumento di metaboliti ad azione ROS protettiva. 3) Caratterizzazione funzionale di geni candidati, ANALISI PROTEOMICA (DIGE) L'espressione proteica in carciofo, a seguito di trattamento con UV-C, utilizzando la tecnologia 2-D DIGE e sono state identificate 151 proteine differenzialmente espresse, di cui 145 sono state identificate con successo mediante spettrometria di massa (ESI-ION Spray). In generale, la maggior parte delle proteine visualizzate ha mostrato un profilo di sovra-regolazione. L'analisi ha evidenziato una maggior risposta ¿precoce¿ allo stress da UV-C (a 6 e 12 ore dopo lo stress), probabilmente come risultato di una adattamento della pianta alle condizioni di stress. L'analisi cluster dei dati ha inoltre permesso di raggruppare i profili di espressione in 6 gruppi principali comprendenti la maggior parte delle proteine regolate (83,3%). GENI CANDIDATI E LORO CARATTERIZZAZIONE Tra le proteine regolate da UV-C si è stato scelto di caratterizzarne tre in particolare: caffeoil-CoA O-metiltrasferasi 1 (CCoAOMT-1), 2- cys perossiredossina (PRX) e transketolasi (TK). La scelta dei geni candidati è stata guidata dal loro coinvolgimento, diretto o indiretto, nel metabolismo dei fenil-propanoidi e dal numero di interazioni potenziali. Lo studio dei promotori ha permesso di isolare circa 400 paia di basi per ognuno dei geni in studio. In queste sequenze sono stati trovati essenzialmente due tipi di domini: un primo tipo di risposta alla radiazione luminosa ed un secondo di risposta agli stress (biotici e abiotici). Grazie all'isolamento delle regioni codificanti (CDS) dei tre geni in studio, è stato possibile trasformare piante di tabacco per indurne la sovra-espressione e il silenziamento. In totale, 7 costrutti sono stati ingegnerizzati e clonati con successo in Agrobacterium tumefaciens (C58C1) utilizzati per trasformare espianti fogliari di tabacco. Il processo di trasformazione ha permesso di ottenere diverse linee mutanti per ogni costrutto che potranno essere utilizzate in futuro per la caratterizzazione funzionale dei 3 geni in condizioni normali e sotto stress abiotico.