Sviluppo di una metodica nanoHPLC-HRMS per la determinazione di allergeni nella farina di Acheta domesticus

L’aumento della popolazione mondiale e il conseguente aumento della domanda di cibo hanno reso necessaria la ricerca di nuovi alimenti che possano essere destinati al consumo umano: gli insetti sembrano rispondere bene a questa domanda perché sono altamente nutrienti, hanno un elevato contenuto di proteine e la loro produzione impatta poco sull’ambiente. L’entomofagia è praticata in tantissimi paesi nel mondo, specialmente in Asia e America centrale, mentre in Europa non viene praticata allo stesso modo, sia per questioni legate alla legislazione che ne consente la circolazione e il consumo e sia per questioni sociali e culturali. Gli insetti rientrano nell’ambito dei cosiddetti Novel Food, cioè tutti quei cibi che ai sensi della normativa UE non siano stati consumati "in modo rilevante" prima del maggio 1997. Per garantire la sicurezza dei novel food e l’autorizzazione di tali prodotti nel mercato europeo, sono necessarie valutazioni di enti europei e nazionali, tra cui la consulenza scientifica dell’EFSA (Autorità Europea per la Sicurezza Alimentare), che ha di recente dichiarato la sicurezza di larve di tarme della farina (Tenebrio molitor) come novel food. Nella valutazione della sicurezza di un cibo rivestono un ruolo importante le allergie: la quasi totalità delle allergie alimentari sono connesse alle proteine, perciò è necessario valutare se il consumo di insetti possa scatenare reazioni allergiche nel consumatore. Queste possono essere provocate dalla sensibilità individuale, dalla reazione crociata con altri allergeni o da allergeni presenti in mangimi per insetti (come ad esempio il glutine). Lo scopo del lavoro di tesi è stato lo sviluppo di un metodo nanoHPLC-HRMS per la determinazione di proteine conosciute come allergeniche in farina di grillo della specie Acheta domesticus. Le fasi di preparazione e purificazione del campione hanno richiesto diverse prove per la messa a punto dell’estrazione della fase proteica. La farina è stata trattata con un’estrazione sequenziale ai fini di isolare le proteine solubili. Al termine dell’estrazione le proteine sono state sottoposte a digestione triptica e quindi analizzate con strumento nanoHPLC accoppiato a spettrometro di massa ad alta risoluzione. Per l’analisi in bottom-up della farina di grillo è stata messa a punto una separazione cromatografica della durata di 250 minuti utilizzando uno strumento nano-HPLC e una nano-colonna cromatografica. Sono stati identificati peptidi appartenenti ad una proteina già conosciuta come allergenica, la tropomiosina, presente nel grillo in due isoforme, noto allergene presente nei crostacei. In seguito alla selezione di alcuni peptidi marker per tropomiosina I (3) e tropomiosina II (3) essi sono stati caratterizzati grazie all’utilizzo della spettrometria di massa ad alta risoluzione. Gli spettri di massa tandem sono stati acquisiti nelle modalità di attivazione CID (Collision Induced Dissociation) e HCD (High Collision Dissociation).