Individuazione di aneuploidie negli ovociti di bufale allevate in Cina attraverso Ibridazione in situ fluorescente multicolore

Aneuploidy is one of the main causes of fetal and embryonic mortality in mammals. The aneuploidy incidence in domestic ruminants has been little investigated and most of studies are focused on bovine and limited to few chromosomes, whereas oocytes aneuploidy has not been investigated in buffalo so far. In vitro-matured Metaphase II (MII) oocytes with corresponding first polar bodies from three Chinese buffalo breeds (Bubalus bubalis) has been investigated in Murrah (2n= 50, X), Swamp (2n=48, X) and Nili-Ravi (2n= 50, X) to provide a preliminary analysis of aneuploidy incidence. Sample collection has been achieved at Guangxi Buffalo Research Institute (Nanning City, Guangxi, China). A total of 60 and 60 oocytes were collected through needle aspiration from ovaries of slaughtered buffaloes of Murrah (MU) and Swamp (SW), respectively. In addition, 10 oocytes were collected from Nili-Ravi (NR) by ovum pick up. The oocytes were washed by 1x PBS and matured in TCM199 medium supplemented with 10% FBS, FSH and LH hormones at 38,5 °C for 24h at 5% CO2. After maturation, oocytes were washed, exposed to a hypotonic solution and fixed with methanol/acetic acid (1:1). Chromosome specific painting probes (1q, 2q, 3q, 4q, 5q and X cen) were prepared by chromosome micro-dissection and two PCR amplifications (standard + labelling). Aneuploidy was screened by Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) by painting probes on 97 analyzable MII out of 130 in vitro-matured oocytes. In MU, one MII was disomic for the chromosome X cen out 45 of MII oocytes + pb analyzed, whereas one MII showed unreduced chromosome number. In SW, two were nullisomic (one for 5q and the other for X cen) out of 44 MII oocytes + pb analyzed, one presented premature separation of sister chromatids and one MII was tetraploid (4n). In NR no abnormalities were found. In the latter case, the number of analyzed MII were very limited and further investigation is necessary. Further studies are necessary to extend the knowledge on aneuploidy both in oocytes and in sperm to assess the impact on productive and reproductive efficiency, in relation to climatic changes and environmental hazards. In addition, aneuploidy knowledge could be useful for improving the in vitro production of embryos destined to the embryo transfer.

Le aneuploidie sono una delle principali cause di mortalità fetale ed embrionale nei mammiferi. L'incidenza delle aneuploidie nei ruminanti è stata poco studiata e la maggior parte degli studi si è concentrata sui bovini e limitata a pochi cromosomi, mentre le aneuploidie degli ovociti delle bufale non sono mai state studiate finora. In questo studio sono state analizzate le metafasi II (MII) degli ovociti maturati in vitro, con i corrispettivi primi globuli polari, di tre razze di bufale cinesi (Bubalus bubalis) quali Murrah (2n= 50, X), Swamp (2n=48, X) e Nili-Ravi (2n= 50, X) per fornire un'analisi preliminare dell'incidenza dell'aneuploidia. La raccolta dei campioni è stata effettuata presso l’Istituto di Ricerca sulle Bufale della città di Nanning, in Cina. Attraverso l'aspirazione con un ago dalle ovaie delle bufale macellate, sono stati raccolti un totale di 60 ovociti di razza Murrah (MU) e 60 ovociti di razza Swamp (SW). Inoltre, 10 ovociti sono stati raccolti mediante ovum pick up da razza Nili-Ravi (NR). Gli ovociti sono stati lavati in PBS 1X e maturati in terreno di coltura TCM199 supplementtato con 10% di FBS e ormoni FSH e LH, ed infine incubati a 38,5 °C per 24h al 5% di CO2. Dopo la maturazione, gli ovociti sono stati lavati, trattati con una soluzione ipotonica e fissati con metanolo/acido acetico (1:1). Successivamente sono state prodotte le sonde cromosoma-specifiche (1q, 2q, 3q, 4q, 5q e X cen) mediante microdissezione cromosomica e due amplificazioni PCR (standard + marcatura diretta). Le aneuploidie sono state evidenziate mediante Ibridazione Fluorescente In Situ (FISH) su 97 MII analizzabili dei 130 ovociti maturati in vitro. In MU, una MII è risultata disomica per il cromosoma X cen e una è risultata non ridotta su un totale di 45 MII. In SW, due MII sono risultate nullisomiche (uno per 5q e l'altro per X cen), una ha presentato la separazione prematura dei cromatidi fratelli e una MII è risultata tetraploide (4n), su 44 MII. In NR non sono state riscontrate anomalie. In quest'ultimo caso, il numero di MII analizzate è stato limitato e richiede ulteriori indagini. Sono necessari studi addizionali per estendere le conoscenze sulle aneuploidie sia negli ovociti che nello sperma, in modo da valutare l'impatto sull'efficienza produttiva e riproduttiva, in relazione ai cambiamenti climatici e ai rischi ambientali. Inoltre, la conoscenza sulle aneuploidie potrebbe essere utile per migliorare la produzione in vitro di embrioni destinati al trasferimento dell'embrione