CRISPR/Cas9-mediated genome editing in Solanum tuberosum L.: traditional and breakthrough approaches

Potato (Solanum tuberosum L.) is one of the most important cultivated crops in the world because of its high nutritional value and easy management in field. This raises great interest in exploiting cutting-edge biotechnological tools for improving its production and qualitative traits. In recent years, genetic transformation has offered promising perspectives to crop improvement thanks to genome editing strategies. In particular, CRISPR/Cas9 technology allows targeted modification of genomic loci thanks to the nuclease Cas9 that, guided by a short RNA molecule, introduces double strand breaks that are imprecisely repaired by the cell introducing modifications that ultimately lead to gene knockout. Due to its tetraploid status and highly heterozygous genome, genetic transformation of potato is not always easy. This thesis work takes advantage of two different transformation protocols to deliver CRISPR/Cas9 reagents and regenerate gene-edited plants. A first traditional transformation approach based on Agrobacterium tumefaciens coculture was exploited to knock out the functionality of Powdery Mildew Resistance 4 (PMR4), a Susceptibility gene involved in the plant-pathogen interaction. The loss-of-function mutation of this gene improves the plant’s resistance to the oomycete Phytophthora infestans, the etiological agent of late blight (Santillán Martínez et al., 2020). In vitro regenerated potato plantlets proved to be correctly transformed as revealed by the genomic integration of the Cas9 gene. An in-depth genotyping was performed through high resolution melting (HRM) analysis, that allows to detect the presence of mutations in amplicons thanks to their peculiar melting profile. The development of new genome editing technologies in plant breeding has fostered a growing interest for in vitro culture and regeneration protocols, which represent a major bottleneck in the application of these techniques in many plant species of agricultural and industrial interest. A newly published protocol (Maher et al., 2020) exploits ectopic expression of developmental regulator genes (such as Wushel, Shoot Meristemless and Isopentenyl transferase) along with CRISPR/Cas reagents to induce the formation of genetically modified meristems from somatic cells. This system, called de novo induction of gene-edited meristems, doesn’t require tissue culture steps, promising to overcome a bottleneck in plant gene editing. To test whether this protocol is suitable for potato or not, the above-mentioned developmental regulators were expressed and phytoene desaturase (PDS) gene was selected as the editing target. The knockout of this gene may induce an albino phenotype due to the impaired carotenoid biosynthesis and subsequent lack of chlorophylls. Although the regenerated plantlets do not show white tissues (probably due to the fact that not all the four copies of PDS in potato genome are edited), molecular analysis performed through HRM and NGS Illumina sequencing confirmed correct transformation and efficient gene editing.

Grazie al suo alto valore nutrizionale e alla sua facilità di gestione in campo, la patata (Solanum tuberosum L.) è una delle più importanti colture a livello mondiale e questo stimola grande interesse nell’applicazione di tecniche biotecnologiche innovative per il miglioramento della sua produzione e dei suoi caratteri qualitativi. Negli ultimi anni la trasformazione genetica ha aperto nuove prospettive per il miglioramento genetico delle piante grazie all’utilizzo delle tecniche di genome editing, ed in particolare di CRISPR/Cas9. Questa strategia, grazie all’azione della nucleasi Cas9 e di un corto RNA guida, permette di introdurre rotture a doppio filamento in specifiche sequenze di DNA; le rotture vengono poi riparate in maniera imprecisa dai sistemi cellulari di riparo del DNA introducendo così piccole modifiche (inserzioni o delezioni) che conducono alla disattivazione del gene target. Tuttavia la trasformazione genetica della patata non è così semplice a causa del suo genoma tetraploide ed altamente eterozigote. Questo lavoro di tesi prevede l’applicazione di due diversi protocolli che permettono la trasformazione e la rigenerazione di piante di patata geneticamente editate. Un primo approccio di trasformazione basato sulla co-coltura con Agrobacterium tumefaciens è stato applicato per disattivare il gene Powdery Mildew Resistance 4 (PMR4), un gene di suscettibilità coinvolto nelle interazioni pianta-patogeno. La perdita di funzionalità di questo gene migliora la resistenza delle piante alla peronospora di patata, causata dall’oomicete Phytophthora infestans (Santillán Martínez et al., 2020). Le piantine che sono state rigenerate in vitro si sono rivelate correttamente trasformate, come dimostrato dalla presenza nel genoma del gene Cas9, e l’editing sul gene target è stato confermato grazie alla tecnica di high resolution melting (HRM). Quest’ultima, sulla base della valutazione dei profili delle curve di melting di ogni campione, permette di rilevare rapidamente e in maniera semplice eventuali mutazioni all’interno degli ampliconi. Lo sviluppo di nuove tecnologie basate sul genome editing per il miglioramento genetico delle piante ha stimolato un crescente interesse nei confronti dei protocolli di coltura e rigenerazione in vitro, che purtroppo sono spesso inesistenti o poco efficienti per molte piante di interesse agrario ed industriale. Un protocollo pubblicato di recente (Maher et al., 2020) promette di superare questo collo di bottiglia della rigenerazione grazie all’espressione ectopica di geni regolatori dello sviluppo (come WUS, STM e IPT) insieme ai reagenti CRISPR/Cas9, inducendo la formazione de novo di meristemi geneticamente editati a partire da cellule somatiche differenziate, senza la necessità di passaggi di coltura in vitro. Questo sistema è stato ottimizzato per l’applicazione in patata scegliendo come target per l’editing il gene fitoene desaturasi (PDS), la cui disattivazione conferisce un fenotipo albino chiaramente visibile alle piante trasformate a causa del blocco della sintesi dei carotenoidi e ad una conseguente carenza di clorofilla. Anche se le piantine rigenerate non mostrano tessuti bianchi, probabilmente a causa del fatto che non tutte e quattro le copie di PDS sono editate, l’analisi molecolare condotta tramite HRM e sequenziamento Illumina hanno confermato il corretto editing del gene target.