Lettuce (Lactuca sativa) represents an important vegetable crop at world and European level both for fresh consumption and ready-to-eat. Lettuce can be affected by numerous fungal and bacterial pathogens that can be present in the soil, in crop residues, infect weeds or be introduced through the use of infected seeds. Among the fungal pathogens is Fusarium oxysporum f. sp. lactucae agent of lettuce tracheofusariosis, first reported in Japan in 1955 and now widespread globally, mainly due to its high transmissibility via seed. Currently 4 different races are known which greatly complicate the epidemiology of this pathogen. The defense against this pathogen includes agronomic practices to prevent or contain the propagation of the pathogen through the use of healthy plant material, crop rotation, the use of carefully disinfected or separated equipment for the different plots to avoid the transport of residues. infected crops. The direct defense of the crop with natural and biological synthetic fungicides, distributed on the ground or on the crop, has not at the moment allowed to achieve satisfactory results. Genetic resistance is therefore the most effective means of defense currently available to ensure the cultivation of lettuce on land affected by fusarium disease or suitable for intensive cultivation. The first aim of the thesis was to identify susceptible, tolerant and resistant cultivars towards F. oxysporum f. sp. lactucae with the traditional method of selection by direct inoculation of the seedlings with the pathogen and using a method of molecular diagnosis to confirm the presence of the pathogen. Thirty lettuce cultivars were inoculated with F. oxysporum f. sp. lactucae breed 1 and eighty-five others with F. oxysporum f. sp. lactucae race 4. This selection method takes 4-6 weeks. In the case of inoculation with F. oxysporum f. sp. lactucae breed 1, a high percentage of resistant plants and a low percentage of susceptible plants were obtained, while for plants inoculated with F. oxysporum f. sp. lactucae race 4, a low percentage of resistant plants and a high percentage of susceptible plants were obtained, reaching over 95%. The second purpose of the thesis was to monitor the progress of the infection of F. oxysporum f. sp. lactucae race 1 on lettuce seedlings in microcosm with the aim of establishing the optimal moment of application of a PCR test in real time in order to quantify the pathogen and be able to carry out the selection of tolerant and resistant seedlings in the very early stages of crop development, shortening thus the time required for varietal selection is 1-2 weeks. We proceeded with the optimization of a protocol of two real-time PCR assays specific for F. oxysporum f. sp. lactucae race 1 and race 4, which were applied for the amplification and quantification of the DNA extracted from plants artificially inoculated with the pathogen. The average efficiency of the reaction, calculated starting from the slope of the line, was respectively 92% and 95% therefore high therefore the protocols are valid and reliable and it was possible to apply them for the quantification analyzes of the pathogen in the samples of lettuce. This molecular diagnostic technique has allowed the detection of the fungus already 7 days after inoculation, shortening the selection times and moreover, with such an early diagnosis, farmers will be given the opportunity to intervene promptly in the defense against the pathogen, avoiding significant productive and economic losses.
La lattuga (Lactuca sativa) rappresenta un'importante coltura vegetale a livello mondiale ed europeo sia per quanto riguarda il consumo fresco che il ready-to-eat. La lattuga può essere colpita da numerosi patogeni fungini e batterici che possono essere presenti nel terreno, nei residui colturali, infettare piante infestanti o essere introdotti mediante l’impiego di semi infetti. Tra i patogeni fungini si trova Fusarium oxysporum f. sp. lactucae agente della tracheofusariosi della lattuga, segnalato per la prima volta in Giappone nel 1955 e oggi diffuso a livello globale, soprattutto a causa della alta trasmissibilità tramite seme. Si conoscono attualmente 4 razze diverse che complicano notevolmente l’epidemiologia di questo patogeno. La difesa nei confronti di questo patogeno comprende pratiche agronomiche per prevenire o contenere la propagazione del patogeno mediante l’impiego di materiale vegetale sano, la rotazione colturale, l’impiego di attrezzature accuratamente disinfettate o separate per i diversi appezzamenti per evitare il trasporto di residui colturali infetti. La difesa diretta della coltura con fungicidi di sintesi, naturali e biologici, distribuiti al terreno o sulla coltura, non ha al momento permesso di raggiungere i risultati soddisfacenti. Quindi la resistenza genetica è il mezzo di difesa più efficace disponibile attualmente per garantire la coltivazione della lattuga su terreni affetti da fusariosi o vocati ad una coltivazione intensiva. Il primo scopo della tesi è stato quello di individuare cultivar suscettibili, tolleranti e resistenti nei confronti di F. oxysporum f. sp. lactucae con il metodo tradizionale di selezione mediante inoculazione diretta delle piantine con il patogeno e utilizzando un metodo di diagnosi molecolare per confermare la presenza del patogeno. Trenta cultivar di lattuga sono state inoculate con F. oxysporum f. sp. lactucae razza 1 e altre ottantacinque con F. oxysporum f. sp. lactucae razza 4. Questo metodo di selezione richiede 4-6 settimane. Nel caso dell’inoculazione con F. oxysporum f. sp. lactucae razza 1 si è ottenuta un’elevata percentuale di piante resistenti ed una bassa percentuale di piante suscettibili mentre per le piante inoculate con F. oxysporum f. sp. lactucae razza 4 si è ottenuta una bassa percentuale di piante resistenti ed un’elevata percentuale di piante suscettibili che arrivano a superare il 95%. Il secondo scopo della tesi è stato il monitoraggio dell’avanzamento dell’infezione di F. oxysporum f. sp. lactucae razza 1 su piantine di lattuga in microcosmo con il fine di stabilire il momento ottimale di applicazione di una prova PCR in tempo reale per poter quantificare il patogeno e poter realizzare la selezione di piantine tolleranti e resistenti nelle primissime fasi di sviluppo della coltura, abbreviando così i tempi richiesti per la selezione varietale a 1-2 settimane. Si è proceduto con l’ottimizzazione di un protocollo di due saggi PCR in tempo reale specifico per F. oxysporum f. sp. lactucae razza 1 e razza 4, che sono stati applicati per l’amplificazione e la quantificazione del DNA estratto dalle piante inoculate artificialmente con il patogeno. L'efficienza media della reazione, calcolata a partire dalla pendenza della retta, è stata rispettivamente del 92% e del 95% quindi elevata perciò i protocolli sono validi ed affidabili ed è stato possibile applicarli per le successive analisi di quantificazione del patogeno nei campioni di lattuga. Questa tecnica di diagnostica molecolare ha permesso la rilevazione del fungo già 7 giorni dopo l’inoculazione, abbreviando i tempi di selezione ed inoltre, con una diagnosi così precoce, si darà la possibilità agli agricoltori di intervenire tempestivamente nella difesa contro il patogeno, evitando ingenti perdite produttive ed economiche.
Ottimizzazione di un protocollo PCR in tempo reale per la selezione varietale e la quantificazione di Fusarium oxysporum f. sp. lactucae razza 1 e 4
TALEVI PALETTO, ELISABETTA
2020/2021
Abstract
La lattuga (Lactuca sativa) rappresenta un'importante coltura vegetale a livello mondiale ed europeo sia per quanto riguarda il consumo fresco che il ready-to-eat. La lattuga può essere colpita da numerosi patogeni fungini e batterici che possono essere presenti nel terreno, nei residui colturali, infettare piante infestanti o essere introdotti mediante l’impiego di semi infetti. Tra i patogeni fungini si trova Fusarium oxysporum f. sp. lactucae agente della tracheofusariosi della lattuga, segnalato per la prima volta in Giappone nel 1955 e oggi diffuso a livello globale, soprattutto a causa della alta trasmissibilità tramite seme. Si conoscono attualmente 4 razze diverse che complicano notevolmente l’epidemiologia di questo patogeno. La difesa nei confronti di questo patogeno comprende pratiche agronomiche per prevenire o contenere la propagazione del patogeno mediante l’impiego di materiale vegetale sano, la rotazione colturale, l’impiego di attrezzature accuratamente disinfettate o separate per i diversi appezzamenti per evitare il trasporto di residui colturali infetti. La difesa diretta della coltura con fungicidi di sintesi, naturali e biologici, distribuiti al terreno o sulla coltura, non ha al momento permesso di raggiungere i risultati soddisfacenti. Quindi la resistenza genetica è il mezzo di difesa più efficace disponibile attualmente per garantire la coltivazione della lattuga su terreni affetti da fusariosi o vocati ad una coltivazione intensiva. Il primo scopo della tesi è stato quello di individuare cultivar suscettibili, tolleranti e resistenti nei confronti di F. oxysporum f. sp. lactucae con il metodo tradizionale di selezione mediante inoculazione diretta delle piantine con il patogeno e utilizzando un metodo di diagnosi molecolare per confermare la presenza del patogeno. Trenta cultivar di lattuga sono state inoculate con F. oxysporum f. sp. lactucae razza 1 e altre ottantacinque con F. oxysporum f. sp. lactucae razza 4. Questo metodo di selezione richiede 4-6 settimane. Nel caso dell’inoculazione con F. oxysporum f. sp. lactucae razza 1 si è ottenuta un’elevata percentuale di piante resistenti ed una bassa percentuale di piante suscettibili mentre per le piante inoculate con F. oxysporum f. sp. lactucae razza 4 si è ottenuta una bassa percentuale di piante resistenti ed un’elevata percentuale di piante suscettibili che arrivano a superare il 95%. Il secondo scopo della tesi è stato il monitoraggio dell’avanzamento dell’infezione di F. oxysporum f. sp. lactucae razza 1 su piantine di lattuga in microcosmo con il fine di stabilire il momento ottimale di applicazione di una prova PCR in tempo reale per poter quantificare il patogeno e poter realizzare la selezione di piantine tolleranti e resistenti nelle primissime fasi di sviluppo della coltura, abbreviando così i tempi richiesti per la selezione varietale a 1-2 settimane. Si è proceduto con l’ottimizzazione di un protocollo di due saggi PCR in tempo reale specifico per F. oxysporum f. sp. lactucae razza 1 e razza 4, che sono stati applicati per l’amplificazione e la quantificazione del DNA estratto dalle piante inoculate artificialmente con il patogeno. L'efficienza media della reazione, calcolata a partire dalla pendenza della retta, è stata rispettivamente del 92% e del 95% quindi elevata perciò i protocolli sono validi ed affidabili ed è stato possibile applicarli per le successive analisi di quantificazione del patogeno nei campioni di lattuga. Questa tecnica di diagnostica molecolare ha permesso la rilevazione del fungo già 7 giorni dopo l’inoculazione, abbreviando i tempi di selezione ed inoltre, con una diagnosi così precoce, si darà la possibilità agli agricoltori di intervenire tempestivamente nella difesa contro il patogeno, evitando ingenti perdite produttive ed economiche.| File | Dimensione | Formato | |
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