Caratterizzazione dei liposomi mediante Imaging Flow Cytometry

Lo scopo dell’elaborato è analizzare le potenzialità e le limitazioni della tecnica dell’Imaging Flow Cytometry nell’ambito della caratterizzazione dei fenotipi complessi in cellule sintetiche, rappresentate da liposomi. In generale, la citometria a flusso è una tecnica che combina i principi della microscopia a fluorescenza con la propria capacità di focalizzazione idrodinamica, che permette l’analisi ordinata delle singole cellule; i parametri misurabili tramite citometria possono essere sia citoplasmatici che extracitoplasmatici. Il principio di base della citometria a flusso si basa sull’analisi della fluorescenza, cioè la rilevazione di segnali fluorescenti provenienti da sonde o da marcatori opportunamente inseriti in membrana o nel citoplasma. Lo studio analizzato si focalizza sull’utilizzo dell’Imaging Flow Cytometry, ovvero un’estensione della citometria a flusso convenzionale che prevede anche l’acquisizione di immagini. Nella progettazione di cellule artificiali, un grande problema è identificare liposomi con caratteristiche specifiche all'interno di un gruppo vario di liposomi con diverse caratteristiche; queste caratteristiche, chiamate "fenotipi," sono misurabili nel contesto cellulare e possono includere parametri come la concentrazione di una proteina o la forma del liposoma. Il protocollo sperimentale utilizzato nello studio preso in considerazione ha previsto in primo luogo l’analisi di caratteristiche morfologiche relative ai liposomi sulla base delle immagini ottenute dal citometro; quindi sono stati valutati parametri come area, rapporto di aspetto, diametro medio e circolarità. I liposomi che hanno soddisfatto i requisiti imposti dal protocollo sperimentale possiedono quindi le caratteristiche adeguate per le analisi successive relative ai moduli cellulari sintetici, ovvero elementi cellulari le cui dinamiche sono controllate geneticamente. Nel contesto dello studio, vengono esaminati i seguenti moduli: reporter di localizzazione luminale attraverso la yellow fluorescent protein (YFP), monitoraggio della replicazione del DNA collegata alla trascrizione e traduzione, auto – assemblaggio delle proteine in microtubuli batterici, spostamento delle proteine Min sulla membrana e, infine, la generazione di fosfatidilserina (PS) mediante l'azione catalitica di PssA (CDP – diacilglicerolo – serina O – fosfatidiltransferasi). Nel contesto della ricerca sulle cellule sintetiche, l'Imaging Flow Cytometry è una tecnologia efficace per lo screening ad alta velocità e l'analisi quantitativa e qualitativa di vari campioni di liposomi. Questo protocollo può essere applicato a diverse metodologie di preparazione dei liposomi. L'Imaging Flow Cytometry permette la selezione precisa di liposomi con tratti fenotipici desiderati, aprendo la strada all'evoluzione diretta delle cellule sintetiche e all'arricchimento di varianti genetiche. Tuttavia, è importante considerare la corrispondenza con i sistemi cellulari reali, poiché le differenze nella composizione della membrana dei liposomi e altre variabili possono influenzare i risultati. Gli studi in vitro e l'integrazione dell'Imaging Flow Cytometry con sistemi microfluidici di produzione di liposomi sono fondamentali per garantire la congruenza con i sistemi cellulari reali. Questa tecnologia offre un potente strumento per la ricerca in biologia sintetica e la creazione di cellule sintetiche avanzate.