Studio di circ-ZNF609 come prototipo di RNA circolare – biosintesi, funzioni e implicazioni patologiche.

Gli RNA circolari (circRNAs) sono molecole di RNA a singolo filamento, chiuse covalentemente a formare un anello, presenti in molti tipi cellulari e nei virus. I circRNAs vengono generati dalla maturazione del trascritto primario di RNA attraverso un evento di splicing alternativo definito back-splicing. Diversi fattori influenzano la biogenesi dei circRNA, tra cui il legame con proteine leganti l’RNA e la presenza di specifiche modificazioni post-trascrizionali. Un prototipo di circRNA è circ-ZNF609, la cui biogenesi è attivata dalla metilazione dell’N in posizione 6 dell’adenosina (m6A) in siti specifici, ad opera di metiltrasferasi dette m6A writer, come ad esempio la metiltransferasi-like-3 (METTL3). L’evento di back-splicing, che vede l’esone 2 del trascitto circolarizzare su stesso con legame covalente dell’estremità 5’ donatrice di splicing a valle con l’estremità 3’ accettrice di splicing a monte, anzichè lo splicing canonico di rimozione degli introni per la formazione del RNA messaggero maturo lineare, è promosso dal legame della proteina YTHDC1 caratterizzata dalla presenza del dominio YTH e denominata “m6A reader” in quanto capace di riconoscere e legare i siti di m6A. Studi di silenziamento genico dimostrano che in assenza di METTL3 e di YTHDC1 il contenuto cellulare di alcuni circRNAs diminuisce e si accumulano i loro trascritti precursori, indipendentemente dal tipo cellulare in cui viene condotto l’esperimento. Mediante sequenziamento del RNA totale della porzione citoplasmatica e nucleoplasmatica si evince che una particolare firma molecolare di m6A, generata nel nucleo, è determinante per la biogenesi dei circRNA mediata da METTL3 e YTHDC1, di cui circZNF-609 fa parte. Circ-ZNF609 ha un ruolo fisiologico nei fenomeni di proliferazione dei mioblasti caratteristico della miogenesi, è deregolato nella distrofia muscolare di Duchenne e un suo accumulo patologico è stato riscontrato nei tumori muscoloscheletrici pediatrici come il rabdomiosarcoma alveolare (ARMS) ed embrionale (ERMS). Il silenziamento di circ-ZNF609 nelle cellule di ERMS porta ad un arresto consistente della proliferazione cellulare, una regolazione negativa dei geni implicati nel ciclo cellulare e un arresto della progressione tra la fase G1 e la fase S, da attribuirsi all’ inibizione della poteina Retinoblastoma Rb e della proteina Akt. Circ-ZNF609 controlla la degradazione di p-Akt a livello del proteasoma. Inoltre, circ-ZNF609 può essere tradotto in proteina in quanto possiede un codone di inizio AUG nel locus genico di ZNF609 e un codone di stop che orgina 3 nucleotidi dopo la giunzione di back-splicing in una corretta sequenza di lettura (open reading frame) di 753 nucleotidi e viene attivamente tradotto dalla cellula in maniera dipendente dallo splicing, come dimostrato da esperimenti di sedimentazione nella frazione pesante polisomica dopo centrifugazione in gradiente di sucrosio. La sua traduzione avviene in modo cap-indipendente, grazie alla presenza di specifiche sequenze interne riconosciute dai ribosomi, dette internal ribosome entry sites (IRES) nella porzione 5’ UTR di circ-ZNF609. Anche la sintesi delle proteine codificate da circ-ZNF609 è regolata dalle m6A METLL3-dipendenti e dalla proteina m6A reader YTHDC3 che, legando direttamente circ-ZNF609, recluta il fattore di inizio della traduzione eIF4G2.