Segnali di calcio e migrazione di cellule endoteliali di origine tumorale: ruolo della Proteina Chinasi A

La neovascolarizzazione è un processo fondamentale per l'accrescimento e la diffusione di tumori solidi. E' stato dimostrato che l'acido arachidonico (AA), liberato dalle membrane cellulari a seguito di stimoli pro-angiogenici, induce un aumento della concentrazione di Ca2+ intracellulare che regola la proliferazione e la motilità di cellule endoteliali (ECs) ¿normali¿ e ottenute da tessuti tumorali. In ECs di aorta bovina, l'AA attiva la produzione di monossido d'azoto (NO) ed è in grado di mediare l'ingresso di Ca2+ sia in modo diretto, agendo sui canali, sia in modo indiretto, attivando l'ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS), a sua volta responsabile dell'ingresso di Ca2+. Saggi di proliferazione e tubulogenesi in vitro in breast-tumor derived ECs (B-TECs) hanno rivelato un ruolo critico dell'AA nel promuovere la proliferazione e la formazione di strutture ¿capillari- simili¿ organizzate, suggerendo quindi un potenziale ruolo pro- angiogenico dell'acido grasso nella neo-vascolarizzazione tumorale. In questo lavoro di tesi si è voluta investigare la complessa regolazione dei segnali di Ca2+, paragonando B-TECs con ECs di microcircolo umano con fenotipo ¿normale¿ (HMECs): in particolare abbiamo focalizzato l'attenzione sui molteplici ruoli della via dipendente da cAMP e proteina chinasi A (PKA), implicata in processi di neovascolarizzazione e nella fosforilazione di eNOS e di alcuni canali del Ca2+ di membrana. I risultati ottenuti suggeriscono che la via cAMP/ PKA svolge un ruolo centrale nel processo angiogenico in vitro, e tale via di segnalazione è indispensabile per l'attivazione dei segnali di Ca2+ indotti da AA. L'AA, infatti, è in grado di indurre l'attivazione di eNOS in modo PKA-dipendente, determinando un rilascio di NO. Gli esperimenti di wound-healing e di imaging del Ca2+ mostrano che l'aumento di NO induce un ingresso di Ca2+ e che tale evento svolge un ruolo significativo nel controllo della migrazione di B-TECs. Infatti, l'ingresso di Ca2+ indotto da AA, e la conseguente migrazione cellulare, sono significativamente influenzate dagli inibitori di eNOS (L-NAME) e da ¿scavenger¿ di NO (PTIO), suggerendo che il rilascio di NO sia funzionalmente coinvolto nella segnalazione dipendente dall'acido grasso. E' ipotizzabile che PKA possa mediare l'attivazione di segnali di Ca2+ sia attraverso la fosforilazione di eNOS sia attraverso la fosforilazione di alcuni canali ionici permeabili al calcio: l'incubazione con il carbossiamidotriazolo (CAI), un farmaco anti-angiogenico bloccante dei canali del Ca2+, infatti, previene la motilità indotta da AA in B-TECs. La via di segnalazione dipendente da cAMP/PKA può anche svolgere un ruolo autonomo: la forskolina, attivatore specifico della adenilato ciclasi, esercita effetti pro-angiogenici e la stimolazione di B-TECs con forskolina determina un ingresso di Ca2+ interamente dipendente dal reclutamento di eNOS e dal rilascio di NO. Complessivamente i risultati ottenuti indicano che PKA ricopre un ruolo multiplo e centrale nella mediazione dei segnali di calcio e nella migrazione indotta da AA in B-TECs, tramite un meccanismo di regolazione molto complesso. Tale processo non si verifica nelle cellule endoteliali con fenotipo normale. Il ruolo pleiotropico di PKA, con implicazioni in un numero molto elevato di vie di segnalazione, è perciò di grande interesse per la comprensione dei meccanismi molecolari che regolano le funzioni endoteliali durante la neovascolarizzaizone tumorale.