The work of thesis has been carried out in the D-MUSIC project (Diamond-based MUliti-task SensIng Chip for neuroscience). The target of the project is the development of an innovative artificial diamond-based biosensor equipped with a graphic micro-channels array in order to detect the electrochemical signals produced from in vitro cellular samples. Diamond material was selected because of its outstanding chemical-physical properties, such as the chemical inertia, the biocompatibility and its tissue equivalence. Thanks to these properties, it is the ideal candidate for carrying out electro-physical measurements. Moreover, it is possible to alter its electrical properties modifying the crystallographic structure through MeV Ion Beam Lithography. The diamond samples were created by means of CVD (Chemical Vapor Deposition) and successively 16 micro-channels were produced using the Ion Beam Lithography. After thermal treatment, regions highly damaged by ions, having MeV energy, located at a few µm below the surface were converted into graphite making the channel electrically conductive. This device allows detecting the exocytotic events that are the secretion of neurotransmitters at the cellular level. The quanta release of these biomolecules from the neurons, it is at the base of synaptic transmission. This mechanism plays a key role in cerebral activity: the investigation of these events is an ongoing activity in the neuroscience field, especially for neurodegenerative disease research, such as Alzheimer and Parkinson. The PC12 cell line was used as an experimental model to study the secretion activity. This cellular chain descends from a pheochromocytoma of the rat adrenal medulla, that has an embryonic origin from the neural crest that has a mixture of neuroblastic cells and eosinophilic cells. This line was used because of its extreme pharmaceutical manipulation versatility and its ease of cultivation. The thesis work is structured in three phases: the assembling of the biosensor, its successive characterization using the cyclic voltammetry and at the end, the use of the whole experimental setup to investigate the amperometric signals produced by PC12 in normal conditions and after using two different molecules: TEA ( 135 mM Tetraethylammonium chloride solution ) useful to block voltage-dependent Potassium (K+) channels, in favour to Calcium (Ca2+) ones and successively adding Isradipine that is a beta-blocker of Calcium channels type L Calcium is the primarily responsible of exocytosis, in fact analyzing the collected data it was possible to underline the frequency of exocytotic events in relation to the change in concentration of Isradipine. Samples treated with TEA show an increased number of amperometric signals, whereas the samples analysed with the Isradipine show a significant reduction of the spikes compared to control samples.
Il lavoro di tesi si colloca all'interno del progetto D-MUSIC (Diamond-based MUlti-task SensIng Chip for neuroscience), il cui obiettivo è lo sviluppo di un innovativo bio-sensore in diamante artificiale dotato di un array di micro-canali grafitici per poter rivelare i segnali elettrochimici prodotti da campioni cellulari in vitro. E' stato utilizzato il diamante per le sue ottime proprietà chimico-fisiche, quali l'inerzia chimica, la biocompatibilità e il fatto di essere tessuto equivalente, che lo rendono il candidato ideale per effettuare misure elettrofisiologiche. In particolare è possibile alterare le sue proprietà elettriche modificandone la struttura cristallina mediante litografia ionica. I diamanti artificiali utilizzati sono stati creati con tecnica CVD (Chemical Vapor Deposition) e in seguito, sono stati microfabbricati 16 canali tramite la tecnica della litografia a fascio ionico. Mediante trattamento termico,le regioni altamente danneggiate dagli ioni, aventi energia del MeV, localizzate ad alcuni µm sotto la superficie, vengono convertite in grafite rendendo pertanto i canali elettricamente conduttivi. Il dispositivo proposto consente la rivelazione dell'esocitosi, la secrezione a livello cellulare di neurotrasmettitori. Il rilascio in quanti di queste biomolecole da parte dei neuroni è alla base della trasmissione sinaptica, meccanismo chiave dell'attività celebrale: la rivelazione di questi eventi è quindi di primaria importanza nel campo delle neuroscienze soprattutto per lo studio delle malattie neurodegenerative quali Parkinson e Alzheimer. Come modello sperimentale per lo studio della secrezione è stata utilizzata la linea cellulare PC12 ossia feocromocitoma (tumori rari derivanti da cellule di cromaffina del midollo surrenale) di ratto: essa infatti possiede un'estrema versatilità per la manipolazione farmacologica e una grande facilità di coltura. Il lavoro di tesi si divide in tre fasi: l'assemblaggio del biosensore in diamante, la sua successiva caratterizzazione elettrica mediante la tecnica della voltammetria ciclica e l'impiego del setup sperimentale realizzato per la misurazione di segnali amperometrici prodotti da cellule PC12 sia in condizioni normali sia stimolate con TEA ( una soluzione contenente 135mM di Tetraetilammonio cloruro) che blocca i canali del potassio(K+), favorendo l'apertura di quelli del calcio(Ca2+), e successivamente aggiungendo l'Isradipina (C19H21N3O5 ossia un beta-bloccante dei canali del calcio (Ca2+) di tipo L. Essendo il calcio il primario responsabile dell'esocitosi, dall'analisi dai dati raccolti è stato possibile evidenziare come cambia la frequenza degli eventi di secrezione in seguito alla variazione di concentrazione di isradipina: si è visto rispetto ai campioni di controllo un aumento dell'attività nelle cellule stimolate tramite TEA mentre una drastica diminuzione a seguito dell'aggiunta di Isradipina.
Assemblaggio, caratterizzazione e utilizzo di biosensori in diamante artificiale
FRESCHINI, ALESSANDRO
2019/2020
Abstract
Il lavoro di tesi si colloca all'interno del progetto D-MUSIC (Diamond-based MUlti-task SensIng Chip for neuroscience), il cui obiettivo è lo sviluppo di un innovativo bio-sensore in diamante artificiale dotato di un array di micro-canali grafitici per poter rivelare i segnali elettrochimici prodotti da campioni cellulari in vitro. E' stato utilizzato il diamante per le sue ottime proprietà chimico-fisiche, quali l'inerzia chimica, la biocompatibilità e il fatto di essere tessuto equivalente, che lo rendono il candidato ideale per effettuare misure elettrofisiologiche. In particolare è possibile alterare le sue proprietà elettriche modificandone la struttura cristallina mediante litografia ionica. I diamanti artificiali utilizzati sono stati creati con tecnica CVD (Chemical Vapor Deposition) e in seguito, sono stati microfabbricati 16 canali tramite la tecnica della litografia a fascio ionico. Mediante trattamento termico,le regioni altamente danneggiate dagli ioni, aventi energia del MeV, localizzate ad alcuni µm sotto la superficie, vengono convertite in grafite rendendo pertanto i canali elettricamente conduttivi. Il dispositivo proposto consente la rivelazione dell'esocitosi, la secrezione a livello cellulare di neurotrasmettitori. Il rilascio in quanti di queste biomolecole da parte dei neuroni è alla base della trasmissione sinaptica, meccanismo chiave dell'attività celebrale: la rivelazione di questi eventi è quindi di primaria importanza nel campo delle neuroscienze soprattutto per lo studio delle malattie neurodegenerative quali Parkinson e Alzheimer. Come modello sperimentale per lo studio della secrezione è stata utilizzata la linea cellulare PC12 ossia feocromocitoma (tumori rari derivanti da cellule di cromaffina del midollo surrenale) di ratto: essa infatti possiede un'estrema versatilità per la manipolazione farmacologica e una grande facilità di coltura. Il lavoro di tesi si divide in tre fasi: l'assemblaggio del biosensore in diamante, la sua successiva caratterizzazione elettrica mediante la tecnica della voltammetria ciclica e l'impiego del setup sperimentale realizzato per la misurazione di segnali amperometrici prodotti da cellule PC12 sia in condizioni normali sia stimolate con TEA ( una soluzione contenente 135mM di Tetraetilammonio cloruro) che blocca i canali del potassio(K+), favorendo l'apertura di quelli del calcio(Ca2+), e successivamente aggiungendo l'Isradipina (C19H21N3O5 ossia un beta-bloccante dei canali del calcio (Ca2+) di tipo L. Essendo il calcio il primario responsabile dell'esocitosi, dall'analisi dai dati raccolti è stato possibile evidenziare come cambia la frequenza degli eventi di secrezione in seguito alla variazione di concentrazione di isradipina: si è visto rispetto ai campioni di controllo un aumento dell'attività nelle cellule stimolate tramite TEA mentre una drastica diminuzione a seguito dell'aggiunta di Isradipina.| File | Dimensione | Formato | |
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https://hdl.handle.net/20.500.14240/150108