CRISPR-cas9: sistema di editing genomico ad alta precisione

The CRISPR system is widely used in the field of genetic engineering because it allows precise modifications to be made in a specific region of DNA. Cells undergoing genomic editing are derived from organoids obtained in the laboratory from human organs or tissues; in fact, it is possible to artificially generate knock-in and knock-out reporter lines and use them to study the consequences of inactivating or mutating specific genes and observe the effects they cause within the cell. This system is more precise than HDR and more efficient in keeping the untreated allele intact. Moreover, its applicability is not limited to the manipulation of constitutively expressed genes but on the contrary, it has also proved extremely useful in marking nonconstitutive genes and in the analysis of rare cell types. To simplify the experimental protocol, targeting plasmids having an independent promoter-regulated selection strategy within them were designed; this simplifies the selection of transfection-positive cells within the culture medium. This strategy has been shown to be optimal both in marking nonconstitutive genes and in identifying transfection-positive cells if the fluorescent marker is not integrated into the plasmid or if it is impossible to induce cell differentiation. Next, attention was turned toward the mode of division of hepatocytes and the mechanisms used by liver cells to maintain the polarity that characterizes the same cell types in the organ in vivo. For this purpose, a dual reporter line TUBB::mNEON - CDH1::tdTomato was designed that allowed real-time monitoring of cell division in human wilde-type hepatocytes. Antecedent to the discovery of this novel technique, keeping track of such a dynamic mechanism required subjecting cell lines to a specific treatment that made them immortal. Through these studies, it was possible to observe diploid cell divisions and the formation of rare polyploid hepatocytes in which the formation of a transient cell membrane between the two daughter cells was manifest, which then ceased to exist in the following fusion event. It was also found that cell division of binucleated hepatocytes was a rare but critical event in maintaining the polyploid state. Inactivation of the tumor gene P53, on the other hand, seemed to promote polyploid cell division and the occurrence of abnormal mitotic spindle behavior, responsible for the appearance of aneuploidies. The CRISPR-HOT system thus could be applied to human organoids of different origins to generate gene knock-in and knock-out models quickly and efficiently; it was also instrumental in finding the driver mutations that appeared systematically in tumor tissues, which were responsible for uncontrolled cell proliferation in favor of the affected cells. CRISPR also enabled the correction of gene mutations in the embryonic stage, preventing the occurrence of serious heart disease, thus also proving to be a valuable tool in the biomedical field.

Il sistema CRISPR è ampliamente utilizzato nel campo dell’ingegneria genetica in quanto permette di apportare modifiche precise in una specifica regione del DNA. Le cellule sottoposte ad editing genomico derivano da organoidi ottenuti in laboratorio a partire da organi o tessuti umani; è possibile infatti generare artificialmente delle linee reporter knock- in e knock-out e utilizzarle per studiare le conseguenze dell’inattivazione o mutazione di geni specifici e osservarne gli effetti che determinano all’interno della cellula. Il sistema in questione risulta più preciso dell'HDR e più efficiente nel mantenere intatto l’allele non trattato. Inoltre la sua applicabilità non è limitata alla manipolazione di geni costitutivamente espressi ma al contrario, si è dimostrato estremamente utile anche nel marcare geni non costitutivi e nell’analisi di rari tipi cellulari. Per semplificare il protocollo sperimentale, sono stati progettati dei plasmidi di targeting aventi al loro interno una strategia di selezione regolata da un promotore indipendente; ciò semplifica la selezione delle cellule positive alla trasfezione all’interno del mezzo di coltura. Questa strategia si è dimostrata ottimale sia nel marcare geni non costituitivi sia nell’identificazione delle cellule positive alla trasfezione nel caso in cui nel plasmide non venga integrato il marcatore fluorescente o nel caso in cui risulti impossibile indurre il differenziamento cellulare. Successivamente l’attenzione è stata rivolta verso la modalità di divisione degli epatociti e sui meccanismi utilizzati dalle cellule epatiche per mantenere la polarità che caratterizza gli stessi tipi cellulari nell’organo in vivo. A tale scopo è stata progettata una doppia linea reporter TUBB::mNEON - CDH1::tdTomato che ha permesso di monitorare la divisione cellulare in tempo reale negli epatociti wilde-type umani. Antecedente alla scoperta di questa tecnica innovativa, per tenere traccia di un meccanismo dinamico come questo era necessario sottoporre le linee cellulari ad un trattamento specifico che le rendeva immortali. Attraverso questi studi è stato possibile osservare le divisioni cellulari diploidi e la formazione di rari epatociti poliploidi nei quali cui si manifestava la formazione di una membrana cellulare transitoria tra le due cellule figlie, che cessava poi di esistere nel in seguito all’evento di fusione. È stato inoltre constatato che la divisione cellulare degli epatociti binucleati fosse un evento raro ma fondamentale per il mantenimento dello stato poliploide. L’inattivazione del gene tumorale P53 invece sembrava promuovere la divisione delle cellule poliploidi e il manifestarsi di un comportamento anormale del fuso mitotico, responsabile della comparsa di aneuploidie. Il sistema CRISPR-HOT quindi può essere applicato agli organoidi umani di diversa provenienza per generare modelli di knock-in e knock-out genico in modo rapido ed efficiente; è stato anche fondamentale per la ricerca delle mutazioni driver che apparivano sistematicamente nei tessuti tumorali, responsabili della proliferazione cellulare incontrollata a favore delle cellule colpite. CRISPR ha permesso anche la correzione di mutazioni geniche nello stadio embrionale, evitando la comparsa di gravi malattie cardiache, dimostrandosi quindi anche un valido strumento in campo biomedico.