Analisi molecolare del gene PINE1 e sviluppo di linee di riso per l'imaging delle gibberelline.

Rice preferentially flowers under short days. Commitment to reproductive growth of the SAM needs to be coordinated with stem elongation. This ensures that the emergence of the panicle from the protecting leaves occurs as its development is complete. During the transition from the vegetative to the reproductive phase, the expression of many genes changes. This thesis focuses on the functional characterization of the most downregulated transcription factor during the flower transition: ZOS12-10 and renamed it PREMATURE INTERNODE ELONGATION 1 (PINE1). PINE1 encodes for a Cys2/His2 zinc finger transcription factor which is expressed at high levels during the vegetative phase at the base of the stem where it acts as a growth suppressor. It interferes with stem elongation by reducing sensitivity to gibberellins. When the plant is induced to flower, the expression of PINE1 is negatively regulated by the rice florigens and this allows the response to gibberellins with consequent stem elongation. To investigate where and how the response to gibberellins is impeded, it has been developed transgenic lines of the cultivar Nipponbare PINE1 wild type and pine1 mutants enable to express the biosensor GIBBERELLIN PERCEPTION SENSOR 1 (GPS1). This biosensor is based on FRET and allows to observe the spatio-temporal distribution of gibberellins in vivo through the detection of fluorescence emission. The function of the biosensor has been confirmed by preliminary analysis under the confocal microscope of first-generation plants. The subsequent optimization of the technique will clarify whether there is a difference in the gibberellins' distribution between PINE1 wild type and mutant lines that may be decisive for the repressive activity of PINE1. Analyzing the sequence of PINE1, was found the presence of two EAR motifs that can interact with co-repressor proteins called TOPLESS. This potential interaction can create a complex that binds proteins which deacetylate histones and compact chromatin thus inhibiting genes transcription in that area. Part of this work aim is to verify the interaction of PINE1 with three TOPLESS proteins expressed simultaneously in meristem tissues. It has been created mutant versions of PINE1 gene for the EAR motifs to confirm the involvement of these domains in the interaction. Thus, PINE1 without EAR domains, PINE1 wild type and TOPLESS constructs were introduced into Gateway expression vectors suitable for protein-protein Yeast Two Hybrid assay in Saccaromyces cerevisiae. To validate the results obtained in yeast it has been performed a fluorescent biomolecular complementation assay (BiFC) in Nicotiana benthamiana. Thanks to these techniques it was possible to confirm the interaction between PINE1 and the three TOPLESS rice proteins and was confirmed the necessity of EAR motifs of PINE1 for interaction with TOPLESS proteins. These results suggest an important biological role for the PINE1 transcription factor that would be involved in chromatin remodeling during the flower transition of the shoot apical meristem of rice.

In riso la fioritura è accompagnata dall'allungamento del fusto ed entrambi i processi sono accelerati in seguito all'accorciamento del giorno. Tale coordinamento permette la corretta emergenza della pannocchia solo in seguito allo sviluppo completo dell'infiorescenza. Durante il passaggio dalla fase vegetativa a quella riproduttiva, cambia l'espressione di molti geni. Questa tesi si concentra sulla caratterizzazione funzionale del fattore di trascrizione che viene maggiormente represso durante la transizione fiorale: ZOS12-10. Esso è stato rinominato PREMATURE INTERNODE ELONGATION 1 (PINE1) in quanto il mutante determina un allungamento precoce degli internodi. PINE1 codifica per un fattore di trascrizione a dita di zinco Cys2/His2 che viene espresso ad alti livelli durante la fase vegetativa negli internodi basali del fusto dove funziona da repressore della crescita. Esso interferisce con l'allungamento del fusto riducendone la sensibilità alle gibberelline. Quando la pianta viene indotta a fiorire l'espressione di PINE1 è regolata negativamente dai florigeni di riso e ciò permette la risposta alle gibberelline con conseguente allungamento del fusto. Per indagare dove e come effettivamente venga ostacolata la risposta alle gibberelline, sono state sviluppate linee transgeniche di riso della cultivar asiatica Nipponbare wild type e mutanti pine1 che esprimessero il biosensore GIBBERELLIN PERCEPTION SENSOR 1 (GPS1). Questo biosensore è basato sulla FRET e permette di osservare la distribuzione spazio-temporale delle gibberelline in vivo attraverso il rilevamento dell'emissione di fluorescenza. La funzionalità del biosensore è stata confermata mediante osservazioni preliminari al microscopio confocale di piante della prima generazione. La successiva ottimizzazione della tecnica consentirà di chiarire se esiste una differenza nella distribuzione delle gibberelline tra le linee PINE1 wild type e mutanti, fattore che può essere determinante per l'attività inibitoria di PINE1. Analizzando la sequenza della proteina PINE1, è stato scoperto che contiene due motivi EAR potenzialmente in grado di interagire con i co-repressori trascrizionali TOPLESS. Tali proteine sono implicate nel reclutamento di deacetilasi istoniche che comportano la compattazione della cromatina e l'inattivazione trascrizionale dei geni target. Una parte di questo lavoro ha l'obiettivo di verificare l'effettiva interazione di PINE1 con tre proteine TOPLESS espresse contemporaneamente nei tessuti meristematici. Per confermare il coinvolgimento dei motivi EAR nell'interazione sono state inoltre create versioni mutanti del gene PINE1 per questi domini. Quindi i costrutti PINE1 privi di motivi EAR, PINE1 wild type e i costrutti TOPLESS sono stati inseriti in vettori di espressione Gateway adatti per effettuare test di interazione proteina-proteina yeast two hybrid in Saccaromyces cerevisiae. Per avvalorare i risultati ottenuti in lievito si sono allestiti saggi di complementazione biomolecolare fluorescente (BiFC) in Nicotiana benthamiana. Grazie a queste tecniche è stato possibile confermare l'interazione tra PINE1 e i tre TOPLESS di riso ed è stata confermata la necessità dei motivi EAR di PINE1 per l'interazione con le proteine TOPLESS. Questi risultati suggeriscono un ruolo biologico importante per il fattore di trascrizione PINE1 che sarebbe coinvolto nel rimodellamento della cromatina durante la transizione fiorale del meristema apicale del germoglio di riso.