Determinazione degli ormoni steroidei in matrice urinaria mediante cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tandem e potenziali applicazioni in ambito clinico

In this thesis work, the biological role of the main endogenous steroids, their metabolism, chemical analysis techniques and strategies for steroid hormones, and the role they play in adrenal gland pathologies are presented. The experimental work focused on developing a quantitative analysis method for 36 steroids in urine matrix a using dilute and shoot approach in liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The developed method was validated using the free software “Methods Validation App” by evaluating the optimal parameters for performing regression, intra-day and inter-day precision and accuracy, limits of detection and quantification, selectivity, matrix effect, and carry-over effect. The method was then employed for the analysis of 167 urine samples from patients with primary aldosteronism (PA), mild autonomous cortisol secretion (MACS), non-functioning adrenal incidentaloma (NFAI), pheochromocytoma (PHEO), and adrenocortical carcinoma (ACC). Additionally, the main hydrolysis methods for steroid metabolites were tested in order to develop new analytical methods in the future. In this context, a new chemical hydrolysis technique was conceived for the simultaneous deconjugation of glucuronated and sulfated steroids. The validation validation process for the quantitative method produced satisfactory results, confirming the validity of the methodology. Similarly, the analysis of urine samples confirmed that the method is adequate for studying the selected cohort of patients. Statistical analysis of the obtained data, performed using the Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests, showed significant differences in the secretion of glucuronated androgens in the MACS group compared to the NFAI group, increased production of glucocorticoids in PHEO compared to PA, and in the MACS group compared to PA.

In questo lavoro di tesi vengono presentati il ruolo biologico dei principali steroidi endogeni, il loro metabolismo, le tecniche e strategie di analisi chimica per gli ormoni steroidei e il ruolo che ricoprono nelle patologie a carico del surrene. Il lavoro sperimentale si è concentrato sullo sviluppo di una metodica di analisi quantitativa per 36 steroidi in matrice urinaria tramite dilute and shoot in cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). Il metodo sviluppato è stato validato utilizzando il software gratuito “Methods Validation App” valutando i parametri ottimali per effettuare la regressione, la precisone e accuratezza intra-day e inter-day, i limiti di rilevabilità e quantificazione, la selettività, l’effetto matrice e l’effetto carry-over. Il metodo è stato quindi impiegato per l’analisi di 167 campioni di urina appartenenti a pazienti affetti da aldosteronismo primario (PA), lieve secrezione autonoma di cortisolo (MACS), incidentaloma surrenalico non secernente (NFAI), feocromocitoma (PHEO) e carcinoma adrenocorticale (ACC). Sono stati inoltre testati i principali metodi di idrolisi per i metaboliti steroidei nell’ottica di uno sviluppo futuro di nuove metodiche di analisi. In questo contesto è stata ideata una nuova tecnica di idrolisi chimica per la deconiugazione contemporanea di steroidi glucuronati e solfati. La validazione del metodo quantitativo ha prodotto dei risultati soddisfacenti confermando la validità della metodica. L’analisi dei campioni d’urina, analogamente, ha confermato l’adeguatezza del metodo per lo studio della coorte di pazienti selezionata. L’analisi statistica dei dati ottenuti è stata effettuata utilizzando i test di Kruskal–Wallis e Mann-Whitney , ha mostrato differenze significative nella secrezione di androgeni glucuronati nel gruppo delle MACS rispetto al gruppo NFAI, un’aumentata produzione di glucocorticoidi in PHEO rispetto a PA e nel gruppo MACS rispetto a PA.