Genome editing mediante CRISPR/CAS9 per silenziare geni di suscettibilità a Plasmopara viticola in Vitis vinifera

The grapevine (Vitis vinifera), belonging to the family Vitaceae isdistributed in Asia, North America, and Europe, is the plant of choice and use for the wine industry. Plasmopara viticola, the causal agent of grapevine downy mildew, represents a serious threat to the wine industry, with negative effects on grape production and quality that are exacerbated by climate change conditions. To effectively manage the progression of infections and protect grapevines from the harmful impact of the disease while safeguarding the environment, it is essential to develop sustainable solutions. One such approach is genome editing aimed at identifying and silencing genes involved in the plant's response to the disease through the CRISPR/CAS9 system. The aim of this work is to develop a protocol for the transformation of embryogenic and non-embryogenic calli mediated by CRISPR/CAS9 technology to silence a putative susceptibility gene to P. viticola. The key steps of this work were: i) designing two guide RNA (sgRNA) sequences complementary to the target region of the gene; ii) cloning the sgRNA sequences into a plasmid vector containing the gene encoding the Cas9 protein; iii) introducing the plasmid vector into Agrobacterium tumefaciens cells to be used for transforming plant cells; iv) producing plant cells (embryogenic and non-embryogenic). The protocols applied and developed during the experimentation not only enabled the efficient production of embryogenic cells and non-embryogenic calli obtained from flowers and leaf explants of Pinot Noir and Mgaloblishvili and their maintenance, but also the acquisition of A. tumefaciens cells containing the plasmid vector for the transformation of plant cells. The transformation of plant cells will thus allow evaluation of whether the construct will be able to effectively edit the genome or not.

La vite (Vitis vinifera), appartenente alla famiglia delle Vitacee con distribuzione in Asia, Nord America ed Europa, risulta essere la pianta di vocazione e utilizzo per l'industria vitivinicola. Plasmopara viticola, agente eziologico della peronospora della vite, rappresenta una seria minaccia per l'industria vitivinicola, con effetti negativi sulla produzione e sulla qualità dell'uva che si aggravano con le condizioni di cambiamento climatico. Per gestire efficacemente l'avanzare delle infezioni e proteggere le viti dall'impatto dannoso della malattia in un’ottica di salvaguardia dell’ambiente, è essenziale sviluppare soluzioni sostenibili. Uno di questi approcci è il genome editing volto alla individuazione e silenziamento dei geni coinvolti nella risposta della pianta alla malattia attraverso il sistema CRISPR/CAS9. Lo scopo di questo lavoro è la messa a punto di un protocollo di trasformazione di calli embriogenetici e non, mediato dalla tecnologia CRISPR/CAS9, per il silenziamento di un putativo gene di suscettibilità a P. viticola. I passaggi chiave di questo lavoro sono stati: i) progettazione di due sequenze di RNA guida (sgRNA) complementari alla regione bersaglio del gene; ii) clonazione delle sequenze degli sgRNA in un vettore plasmidico contenente il gene che codifica per la proteina Cas9; iii) introduzione del vettore plasmidico in cellule di Agrobacterium tumefaciens da utilizzare per trasformare le cellule vegetali; iv) produzione di cellule vegetali (embriogenetiche e non). I protocolli applicati e messi a punto durante la sperimentazione hanno permesso non solo la produzione efficiente di cellule embriogeniche e calli non embriogenetici ottenuti da fiori ed espianti fogliari di Pinot nero e Mgaloblishvili ed il loro mantenimento, ma anche l’ottenimento di cellule di A. tumefaciens contenenti il vettore plasmidico per la trasformazione delle cellule vegetali. La trasformazione delle cellule vegetali permetterà dunque di valutare se il costrutto sarà in grado di editare efficacemente oppure no il genoma.