Dosaggio del cortisolo salivare nei bovini e sviluppo di un test immunocromatografico a flusso laterale per il monitoraggio in loco dello stress animale

Cortisol is the main hormone synthesized by the adrenal cortex in response to the activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis, the neuroendocrine stress regulation system. The ever-increasing interest towards animals well-being, not only physical but also mental (the positive animal welfare concept, PAW), allows us to consider cortisol as an excellent biomarker for the evaluation of stress, especially in its acute form. Herein its dosage in salivary matrix, a matrix that has several advantages compared to the most used and studied plasma, using ELISA kit, and the subsequent attempt to develop a rapid lateral flow immunoassay (LFIA) in a competitive indirect format is described. This is a method that allows distinguishing stressed and non-stressed animals based on a cut-off defined through the quantification itself. The system exploits cortisol conjugated to BSA as a competitor for the signal reporter, consisting of anti-cortisol monoclonal antibodies adsorbed on gold nanoparticles (GNPs). The treatment of the GNPs, the quantities of conjugated antibody, competitor, label used, the position of the test line and the reading time of the device are all the parameters developed in buffer in this work, sometimes through experimental design (DoE). The attempt to use it in the matrix does not show the disappearance of the signal for the animals considered stressed but, in any case, the signal was halved near the identified cut-off. Subsequent studies on the elimination of the matrix effect should lead to create the desired system.

Il cortisolo è il principale ormone sintetizzato ad opera della corteccia surrenale in risposta all’attivazione dell’asse ipotalamo-ipofisi-surrene (HPA), sistema di regolazione neuroendocrino dello stress. L’interesse sempre più crescente nei confronti del benessere, non solo fisico ma anche mentale, degli animali (concetto del benessere positivo dell’animale, PAW), permette di considerarlo come un ottimo biomarcatore per la valutazione dello stress, soprattutto nella sua forma acuta. In questo lavoro è descritto il suo dosaggio in matrice salivare, una matrice che presenta diversi vantaggi rispetto alla più utilizzata e studiata plasmatica, mediante kit ELISA, e il successivo tentativo di sviluppo di un test rapido immunocromatografico a flusso laterale (LFIA) in formato competitivo indiretto che consenta di distinguere animali stressati e non, sulla base di un cut-off definito tramite la quantificazione stessa. Il sistema sfrutta il cortisolo coniugato alla BSA come competitore per il reporter di segnale, costituito da anticorpi monoclonali anti cortisolo adsorbiti sulle nanoparticelle d’oro (GNP). Il trattamento delle GNP, le quantità di anticorpo coniugato, di competitore, di marcato utilizzato, la posizione della linea di test e il tempo di lettura del dispositivo sono tutti i parametri messi a punto in tampone, talvolta anche mediante disegno sperimentale (DoE). Il tentativo di utilizzo in matrice non mostra la scomparsa del segnale per gli animali considerati stressati ma, comunque, questo si dimezza in prossimità del cut-off identificato. Studi successivi sull’abbattimento dell’effetto matrice dovrebbero portare a poter realizzare il sistema desiderato.