L'analisi multivariata nella progettazione della robustezza di un metodo analitico per il test di conferma delle aminoacidopatie

L’obiettivo di questo elaborato è lo sviluppo e la validazione di un metodo analitico robusto per i test di conferma delle aminoacidopatie nel contesto dello screening neonatale esteso. Si punta a valutare la resistenza del metodo alle variazioni ambientali e sistematiche per garantire prestazioni affidabili e riproducibili. Lo scopo finale è assicurare risultati coerenti e attendibili, indipendentemente dalle condizioni operative, mettendo in evidenza il concetto di robustezza attraverso l'ottimizzazione delle fasi critiche del metodo analitico. Questo studio contribuisce al miglioramento delle fasi di validazione di un metodo analitico per la diagnosi precoce delle aminoacidopatie neonatali, facilitando l'attivazione tempestiva delle procedure terapeutiche appropriate. Lo sviluppo prevedeva l’individuazione della tecnica cromatografica più adatta e la successiva analisi di 11 analiti (aminoacidi) all’interno di campioni di plasma. Si enfatizza l'importanza di comprendere le proprietà chimico-fisiche degli aminoacidi per selezionare il metodo cromatografico più idoneo, valutando parametri come il punto isoelettrico (pI) e la costante di dissociazione acida (pKa). Utilizzando il Design of Experiments, si sceglie infine la tecnica HPLC-MS/MS con una colonna innovativa chiamata Raptor Polar X, che lavora con l’approccio mixed-mode ed è adatta alla separazione degli analiti sulla base della loro polarità e carica. Si regola selettivamente la ritenzione dei composti d'interesse, mantenendo un flusso costante e modificando il gradiente di concentrazione della fase mobile, in modo da usufruire dell’approccio HILIC e dell’approccio a scambio ionico a seconda delle necessità separative. Si utilizza un detector MS/MS in modalità ESI+ e MRM per un'analisi dettagliata e selettiva. Infine, si valuta la robustezza del metodo tramite la costruzione di una Matrice di Yates, identificando le interazioni e gli effetti significativi delle variabili. L'analisi, grazie all’applicazione del Test di Fisher, conferma la robustezza del metodo, indicando che i risultati ottenuti sono consistenti e validi nelle condizioni testate.