Caratterizzazione biofisica dell'interazione tra Trimetilammina N-ossido e le proteine

Il lavoro ha come obiettivo la caratterizzazione biofisica dell'interazione tra una piccola molecola organica, trimetilammina N-ossido (TMAO), e le proteine. TMAO è presente in una moltitudine di organismi viventi nei quali ha evidenziato un importante ruolo come osmolita ed è presente nel corpo umano dall'ossidazione di un metabolita, la trimetilammina, derivante dal consumo di specifici nutrienti. Negli ultimi anni crescente attenzione è stata riservata all'analisi della possibile correlazione tra il livello di TMAO nel plasma e l'insorgere di importanti patologie, tra cui le malattie cardiovascolari (CVD). Ad oggi non è chiaro se la relazione sia un legata al ruolo mediatore di TMAO nella condizione clinica oppure si tratti solamente di un biomarker, privo di un'azione diretta nel promuovere la patologia. L'obiettivo di questo progetto è contribuire alla costruzione di una conoscenza più profonda delle proprietà di TMAO, andando ad indagare la sua influenza su una proteina modello, l'albumina di siero bovino (BSA). Parallelamente a TMAO sono stati studiati altri tre osmoliti organici compatibili (betaina, inositolo e sorbitolo) al fine di compararne le proprietà ed estrarre le differenze significative. Esperimenti di denaturazione, chimica e termica, sono presentati per studiare la capacità stabilizzante di TMAO nei confronti della conformazione proteica nativa. Studi in fluorescenza mostrano la capacità di TMAO di contrastare l'effetto denaturante dell'urea e test al DSC (Differential Scanning Calorimetry) evidenziano un effetto protettivo verso la denaturazione termica. TMAO risulta inoltre in grado di modificare il pathway di denaturazione proteica, conducendo a una denaturazione senza l'intermedio stabile tipico della BSA. Misure in DLS (Dynamic Light ) hanno consentito di osservare direttamente l'effetto compattante dell'osmolita sulla struttura tridimensionale della proteina. L'aggiunta di TMAO riduce la dimensione idrodinamica della proteina, inoltre test in presenza combinata TMAO-urea confermano l'abilità di TMAO di proteggere la forma nativa dall'azione denaturante. Infine una serie di simulazioni di dinamica molecolare (MD) ha permesso di ipotizzare le regioni proteiche più influenzate dall'azione dell'osmolita e di analizzare la variabilità energetica del sistema e dei legami idrogeno nell' interazione urea-TMAO. In conclusione, questo lavoro dimostra come la presenza di TMAO risulti in un effetto sulla struttura della proteina, promuovendone la stabilizzazione e la resistenza agli agenti perturbanti, oltre alla capacità di modificare la conformazione tridimensionale nativa della proteina. I risultati ottenuti sono in accordo con le teorie sull'interazione proteina-osmolita e forniscono interessanti dettagli che potrebbero avere un'implicazione rilevante nel svelare il possibile coinvolgimento di TMAO nei processi fisiopatologici.

The aim of the project is the biophysical characterization of the interaction between a small organic molecule, trimethylamine N-oxide (TMAO), and proteins. TMAO is present in a variety of living organisms in which it has shown an important role as an osmolyte and it si also found in the human body from the oxidation of a metabolite, trimethylamine, resulting from the consumption of specific nutrients. In recent years increasing attention has been paid to the analysis of the possible correlation between the level of TMAO in plasma and the onset of important diseases, in particular cardiovascular disease (CVD). It is not clear whether the molecule is a mediator in the clinical condition or it is only a biomarker, without direct action in promoting the disease. The goal of this work is contribute to the construction of a deeper understanding of the properties of TMAO by investigating its influence on a model protein, bovine serum albumin (BSA). In parallel with TMAO, three other compatible organic osmolytes (betaine, inositol and sorbitol) were studied in order to compare their properties and extract significant differences. Experiments of chemical and thermal denaturation are presented to reveal the stabilizing capacity of TMAO. Fluorescence studies show the ability of TMAO to counteract the denaturing effect of urea and Differential Scanning Calorimetry (DSC) tests prove a protective effect towards thermal denaturation. TMAO is also able to modify the protein denaturation pathway, leading to a denaturation without the stable intermediate, typical of BSA. Measurements in Dynamic Light Scattering (DLS) allowed direct observation of the compacting effect of the osmolyte on the three-dimensional structure of the protein. The addition of TMAO reduces the hydrodynamic size of the protein, and combined TMAO-urea tests confirm TMAO's ability to protect the native form in presence of denaturant agent. Finally, a series of molecular dynamics (MD) simulations made possible to localize protein regions most affected by the osmolyte action, analyzed energy variability of the system and hydrogen bonds in the urea-TMAO interaction. In conclusion, the presence of TMAO results in an effect on the structure of the protein promoting its stabilization and resistance to perturbing agents, in addition to the ability to modify the native three-dimensional conformation of the protein. The results obtained are in agreement with the theories on protein-osmolyte interaction, and provide interesting details that could have a relevant implication in revealing the possible involvement of TMAO in pathophysiological processes.