Validazione di un metodo nano HPLC-HRMS per la quantificazione dell'ormone di rilascio delle gonadotropine in campioni biologici.

L'identificazione e la quantificazione di biomarcatori indicanti stati patologici sono processi base degli studi clinici. L'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH, Gonadotropin Releasing Hormone) è un neuro-deca-peptide responsabile della regolazione ormonale dell'apparato riproduttivo negli organismi vertebrati. Esso è coinvolto in patologie associate a questo apparato quali ad esempio l'amenorrea ipotalamica e la sindrome dell'ovaio policistico (PCOS, Poly-Cystic Ovary Syndrome). Questa ultima patologia risulta essere particolarmente comune nelle donne in etá riproduttiva ed è quindi importante trovare un biomarcatore per la sua diagnosi precoce. Il GnRH si è rivelato un buon candidato per questo scopo. Sono state identificate diverse isoforme dell'ormone proteico intra- ed inter-specie e, in particolare, nei mammiferi è presente l'isoforma di tipo I. Il metodo analitico utilizzato per la quantificazione del peptide in matrici biologiche prevede una fase iniziale di trattamento e purificazione del campione e una fase successiva di analisi nano HPLC-HRMS (Orbitrap Fusion). Per la purificazione del campione sono state utilizzate delle cartucce SPE polimeriche a fase inversa per l'arricchimineto del GnRH. Il metodo HPLC-HRMS sviluppato consiste in un'analisi cromatografica con colonna nano C18 da 50 cm preceduta da SPME on line con cartuccia C18. L'analizzatore di massa orbitrap fusion è stato utilizzato con una risoluzione di 60000 per gli spetttri acquisiti in full mass e di 30000 per gli spettri di tandem mass acquisiti con modalitá di attivazione CID (Collision Induced Dissociation). Questo tipo di frammentazione è risultato essere il più sensibile. Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di validare il metodo nano HPLC-HRMS descritto rispettando le indicazioni della Food and Drug Administration. La matrice biologica è stata quindi positivizzata con concentrazioni crescenti e note di analita, il GnRH, e con una concentrazione nota di standard interno, qui rappresentato dalla isoforma del GnRH di lampreda l LHRH-III. Il metodo analitico è stato in seguito utilizzato per quantificare l'analita in campioni reali di plasma umano proveniente da controlli sani e da pazienti affette da PCOS. Il metodo nano HPLC-HRMS sviluppato e validato è risultato sensibile, robusto e selettivo per la quantificazione dei livelli basali e patologici del GnRH, confermando la possibilità di usare il neuro-deca-peptide come biomarcatore della patologia PCOS.